겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생
Summary
Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.
Abstract
The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.
Introduction
신장은 신체로부터 유체 항상성, 혈압 조절과 폐기물의 여과에 필수적이다. 포유 동물이 부상 차별화 된 상피 세포 1-4 사용 후 기존 네프론을 복구 할 수 있지만, 그들은 예약 된 줄기 세포 5의 풀을 결여하는 것, 새로운 네프론 드 노보를 형성 할 수 없습니다. 포유류 달리 성어 부상 6,7에 물고기의 성장 및 응답을 지원하는 성인 일생 동안 새로운 네프론을 형성 할 수있다. 제브라 피쉬, 다니오 레 리오 (rerio)는, 장기 재생 8-10의 연구를위한 귀중한 모델 생물과 인간의 신장의 수리 공학 응용 프로그램에 강력한 통찰력을 제공 할 수있는 잠재력을 가지고있다. Tg는 (Lhx1a : EGFP) 유전자 (11) 그러나, 성인 zebrafish의 신장 (12)에 부상에서 R + 세포 lhx1a의 응답을 제어하는 메커니즘을 네프론의 선조 세포의 풀 라벨을 도시 한분명이 메인.
아미노 글리코 사이드 겐타 마이신은 인간 13 알려진 신 독성 및 ototoxic 효과로 널리 사용되는 항생제이다. 겐타 마이신의 복강 내 주사는 물고기 6 급성 신장 손상을 유도 설립 방법이다. 물고기 모방에서이 부상 관 상피 세포와 과다 복용 14 젠타 마이신 후 인간에서 발생하는 사구체의 흉터의 손실. 겐타 마이신 주사 제브라 피쉬에 부상을 유도하는 것은 생산 된 많은 새로운 네프론으로, 강한, 동기 재생 반응을 유도하고 동시에 형성, 증식과 분화의 단계를 통해 진행하는 편리한 방법입니다.
이 프로토콜은 특이점을 최소화하기 위해 비 침습적 영상 심사 과정을 이용하여 성인 zebrafish의 신장에 강력하고 재현 부상에 대한 우리의 방법을 자세히 설명합니다. 우리는 겐타 마이신과 부상 상피 신장 조직과 형식의 죽음에 이르게한다는 사실을 활용다음 mesonephric 덕트 및 배설강에서 대중에 축적 신 세뇨관 캐스트의 이온. 이러한 어류로 전달되고 물에 육안으로 관찰 할 수있다. 이것은 우리가 다음 추가 실험을 위해 풀링 할 수 있습니다 강력한 치명적 부상, 생선을 선별 할 수 있습니다. 그들은 실험의 종점보다 균일하고 효율적으로 데이터를 수집 및 분석에 이르게 도달하기 전에 손상되지 않은 다이 물고기 또는 물고기의 숫자를 최소화한다. 또한, 특별한 장치 나 시약은 교육 또는 교육 환경에서 사용하기 위해이 방법을 비용 효율적이고 적절하게, 필요하지 않습니다. 우리의 방법을 사용하여, 여기에 우리가 신장 재생에 겐타 마이신 투여 량의 증가 효과뿐만 아니라 온도 상승의 효과를 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제브라 피쉬는 성인 mesonephric 신장 (6)를 포함하여 성인 장기의 재생을 공부에 이상적입니다. 최근의 연구는 더 나은 네프론 재생 과정에서 발생하는 단계의 특성을 분자 마커 및 새로운 유전자 변형 기자 라인의 장점을 촬영하고 7,12 책임 어떤 세포 수 있습니다. 비뇨기 캐스트 관찰 인간 16 신장 질환을 진단 세기 이상 동안 사용되어왔다. 여기에서 우리는 겐타 마이신 주?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1xPBS for working solution |
References
- Humphreys, B. D., et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Humphreys, B. D., et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).
- Guo, J. K., Cantley, L. G. Cellular maintenance and repair of the kidney. Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).
- Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult. Pediatr Nephrol. , (2013).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Dev Biol. 320, 161-174 (2008).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2011).
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , (2011).
- Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day. Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).
- Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling. Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).
- Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).
- Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).
