A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

Summary

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Abstract

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Introduction

O rim é essencial para a homeostase dos fluidos, regulação da pressão arterial e filtragem de resíduos do corpo. Embora os mamíferos são capazes de reparar néfrons existentes após a lesão usando células epiteliais diferenciadas ^1-4, eles parecem não ter um pool de células-tronco reservadas ⁵ e são incapazes de formar novos néfrons de novo. Em contraste com os mamíferos, peixes adultos são capazes de formar novas nefrónios ao longo da vida adulta para apoiar o crescimento dos peixes e, em resposta a uma lesão ^6,7. O peixe-zebra, Danio rerio, é um organismo modelo de valor inestimável para o estudo da regeneração de órgãos ^10/08 e tem o potencial de fornecer insights poderosos em aplicações de engenharia a reparação de rins humanos. A Tg (Lhx1a: EGFP) transgene ¹¹ foi mostrado para identificar um conjunto de células progenitoras no nefrónio do rim adulto zebrafish ^12, no entanto, os mecanismos que controlam a resposta de células lhx1a + para r lesãoemain claro.

A gentamicina é um antibiótico aminoglicosídeo amplamente utilizado com efeitos nefrotóxicos e ototóxicos conhecidos em humanos ^13. Injeção intra-peritoneal de gentamicina é um método estabelecido de induzir lesão renal aguda em peixes ^6. Esta lesão em peixes imita a perda de epitélio tubular e cicatrizes de glomérulos que ocorre em seres humanos após overdose de gentamicina ^14. Indução de lesão no peixe-zebra por injecção de gentamicina é uma maneira conveniente de induzir uma resposta forte de regeneração, síncrona, com muitas novas nefrónios produzidos e procedendo em simultâneo através de estágios de formação, diferenciação e proliferação.

Este protocolo detalhes o nosso método de lesão robusta e reproduzível no peixe-zebra rim adulto, utilizando um processo de triagem visual não invasivo para minimizar valores atípicos. Nós tirar proveito do facto de que a lesão com gentamicina leva à morte do tecido renal epitelial e formatoion de moldes tubulares renais, que depois se acumulam em massas nas condutas mesonéfricos e cloaca. Estes são passados ​​pelos peixes e pode ser observada visualmente na água. Isto permite-nos para triagem de peixe com forte lesão não-letal, que pode então ser combinadas para fazer novas experiências. Minimizando o número de peixes ou peixe ileso que morrem antes de chegar ao ponto final do experimento leva a mais uniforme e eficiente de coleta de dados e análise. Além disso, não são necessários dispositivos especiais ou reagentes, tornando este método custo-efetivo e adequado para uso em um ambiente acadêmico ou de ensino. Utilizando o nosso método, aqui mostram os efeitos de doses crescentes de gentamicina sobre a regeneração do rim, assim como o efeito do aumento da temperatura.

Protocol

Declaração de Ética: NOTA: Todos os experimentos foram realizados de acordo com orientações Hospital Geral de Massachusetts para o uso de animais em pesquisa. 1. Preparação Prévia Determine quantas adulto zebrafish 6-12 meses de idade para ferir. Plano de ferir 10-20% mais peixes do que será necessário. A fim de minimizar a variabilidade, o uso combinado de peixe irmão idade criados em conjunto no mesmo tanque de modo que eles são aproximadamente do mesmo tamanho e tê…

Representative Results

Lesão de gentamicina pode ser confirmado visualmente pela observação de moldes epiteliais renais em água (Figura 1). Diferentes doses de gentamicina foram usadas para ferir adulto zebrafish wildtype TuAB, resultando em um número crescente de lhx1a + agregados celulares no rim regeneração (Figura 1A – D). Gesso branco pode ser facilmente visto na água um dia após a lesão (Figura 1E – H). Uma baixa dose de gentamicina r…

Discussion

O peixe-zebra é ideal para estudar a regeneração de órgãos adultos, incluindo o rim adulto mesonephric ^6. Estudos recentes têm se aproveitado de marcadores moleculares e novas linhas repórter transgénico para melhor caracterizar as etapas que ocorrem durante a regeneração de néfrons e quais as células podem ser responsáveis ^​​7,12. Observação de cilindros urinários foi usado para mais de um século, para diagnosticar a doença renal em seres humanos ^16. Aqui usamos a …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
gentamicin sodium sulfate	Sigma	G1264	TOXIC, purity varies from batch to batch
plastic transfer pipets	Fisher	13-711-7M
1 ml Norm-Ject syringes	Electron Microscopy Sciences	72520	green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately
30G1/2 needles	Becton Dickinson	305106
ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)	Sigma	A5040	IRRITANT
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Make 4% in 1xPBS for working solution