Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon
Summary
Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.
Abstract
The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.
Introduction
Böbrek vücuttan akışkan homeostazı, kan basıncı düzenleme ve atık, süzme için gereklidir. Memeliler yaralanma farklılaşmış epitel hücreleri 1-4 kullandıktan sonra mevcut nefron onarmak için mümkün olsa da, ayrılmış kök hücrelerin 5 havuzu eksikliği gibi görünüyor ve yeni nefron de novo oluşturmak mümkün değildir. Memelilerde aksine, yetişkin balık yaralanma 6,7 balık büyümesini ve karşılık olarak desteklemek için yetişkin yaşam boyunca yeni nefron oluşturabildiği. Zebra balığı, Danio rerio, organ rejenerasyonu 8-10 çalışma için paha biçilmez bir model organizmadır ve insan böbrekler onarımı mühendislik uygulamaları içine güçlü anlayışlar sağlama potansiyeline sahiptir. Tg (Lhx1a: EGFP) transgen Bununla birlikte, 11, yetişkin zebrabalıkları böbrek 12 yaralanma R + hücrelerinin lhx1a tepkisini kontrol eden mekanizmaların nefron progenitör hücrelerin bir havuz etiket gösterilmiştirbelirsiz Emain.
aminoglikozid gentamisin insanlarda 13 bilinen nefrotoksik ve ototoksik etkileri ile yaygın olarak kullanılan bir antibiyotiktir. Gentamisin intraperitoneal enjeksiyon balık 6 akut böbrek hasarı uyaran bir yöntemdir. Balık taklit Bu yaralanma tübüler epitel ve doz aşımı 14 gentamisin sonra insanlarda meydana glomerül yara kaybı. Gentamisin enjeksiyonu ile Zebra balığı yaralanma uyaran üretilen birçok yeni nefron ile güçlü, senkron rejenerasyon yanıtı uyaran ve aynı zamanda oluşumu, çoğalma ve farklılaşma aşamalarından geçerek geçmeden uygun bir yoldur.
Bu protokol aykırı aza indirmek için noninvaziv görsel tarama sürecinin kullanarak yetişkin zebrafish böbrek sağlam ve tekrarlanabilir yaralanma için yöntem ayrıntıları. Biz gentamisin ile yaralanma epitel böbrek dokusu ve biçimi ölümüne yol açtığı gerçeğini yararlanmakDaha sonra mezonefrik kanalları ve cloaca kitleler halinde birikir renal tübüler atmalarını, ion. Bu balıklar tarafından iletilir ve su içinde görsel olarak gözlenebilir. Bu bize daha sonra deneyler için toplanmış olabilir güçlü ölümcül olmayan yaralanma ile balık ekrana verir. Onlar deneyin bitiş daha düzgün ve verimli veri toplama ve analizi yol açar ulaşmadan önce ölmek yaralanmamış balık ya da balık sayıları en aza indirilmesi. Buna ek olarak, özel cihazlar veya reaktif akademik veya öğretim ortamında kullanılmak üzere bu yöntem maliyet-etkin ve uygun hale gereklidir. Bizim yöntemi kullanarak, burada böbrek rejenerasyonu üzerine gentamisin dozu artan etkileri yanı sıra artan sıcaklığın etkisini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
zebra balığı yetişkin mezonefrik böbrek 6 dahil olmak üzere yetişkinlerdeki organların rejenerasyonu çalışmak için idealdir. Son çalışmalar daha nefron rejenerasyon sırasında meydana gelen adımları tanımlamak için moleküler belirteçlerin ve yeni transgenik muhabiri hatları avantaj almış ve 7,12 sorumlu neler hücreler olabilir. Idrar atmalarını Gözlem insanlarda 16 böbrek hastalığı teşhis etmek için bir yüzyılı aşkın süredir kullanılmaktadır. Bu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1xPBS for working solution |
References
- Humphreys, B. D., et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Humphreys, B. D., et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).
- Guo, J. K., Cantley, L. G. Cellular maintenance and repair of the kidney. Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).
- Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult. Pediatr Nephrol. , (2013).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Dev Biol. 320, 161-174 (2008).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2011).
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , (2011).
- Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day. Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).
- Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling. Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).
- Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).
- Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).
