Un alto dosaggio Imaging contenuti per l'identificazione di neurotossina botulinica inibitori
Summary
Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.
Abstract
Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.
Introduction
Il batterio Clostridium botulinum produce neurotossina botulinica, una delle più potenti tossine biologiche conosciute all'uomo 1. Ci sono 7 diversi sierotipi BoNT (BoNT / AG). BoNT / A-Gall indurre paralisi a livello della giunzione neuromuscolare a causa di complessi SNARE proteolisi 2,3. SNARE proteolisi impedisce neurotrasmettitore vescicole-fusione delle membrane e quindi blocchi neurotrasmettitore 4. Il target SNARE specifica dipende dal particolare sierotipo BoNT coinvolti nel processo intossicazione. BoNT / A e BoNT / E fendere SNAP-25, mentre BoNT / C scinde sia SNAP-25 e sintaxina 5. I restanti sierotipi sinaptobrevina fendere (chiamato anche vescicole associata proteina di membrana (VAMP). BoNT / A è stato scelto per lo sviluppo del test in quanto è responsabile di una percentuale elevata di naturale il botulismo e ha la più lunga durata d'azione 6. Sviluppo di piccole molecole terapie contro BoNT / A è un obiettivo importante peril nostro programma di scoperta di nuovi farmaci e ha utilizzato metodi tradizionali di obiettivi per identificare inibitori sito proteolitici attivo 7, 8-10. Tuttavia, la creazione di inibitori del sito attivi con attività ad ampio spettro contro i sierotipi multipli e sull'efficacia dopo l'esposizione sarà probabilmente difficile.
Abbiamo quindi implementato un approccio innovativo, fenotipica droga scoperta che utilizza BoNT SNAP-25 scissione come un endpoint funzionale per identificare piccole molecole in grado di bloccare BoNT-mediata intossicazione del motoneurone. SNAP-25 è necessario per il rilascio dei neurotrasmettitori, come la degradazione di SNAP-25 è predittivo di paralisi e letalità in vivo. Ad esempio, lo screening a base di cellule potrebbe portare alla scoperta di nuovi modulatori di fattori cellulari responsabili della tossina inattivazione o l'inibizione delle vie di tossine all'interno delle cellule bersaglio. Un fattore importante nello sviluppo test fenotipico è la selezione di fisiologicamente rilevanti modelli biologici. We ed altri hanno descritto il mouse staminali embrionali (ES) derivati dalle cellule neuroni motori che ricapitolano il carattere immunologico dei motoneuroni primari, tra cui l'espressione della SNAP-25 11- 13. È importante sottolineare che questi sistemi cellulari sono molto sensibili alle BoNT / A intossicazione e dimostrano scissione dose-dipendente della SNAP-25 in risposta a concentrazioni crescenti di tossina 11,12. I neuroni motori differenziati sono prodotti anche in quantità sufficiente per l'analisi basata piastra throughput elevato e hanno permesso la progettazione di una serie di saggi cellulari.
Il test fenotipico è un metodo di immunofluorescenza che utilizza due anticorpi distinti per quantificare scissione di endogeno espresso pieno lunghezza SNAP-25 durante la BoNT / A intossicazione della cultura del mouse motoneurone. Un terminale carbossilico BoNT / A (BACS) anticorpi scissione-sensibile che riconosce solo a figura intera SNAP-25 permette di valutare BoNT / A proteolisi mediata di SNAP-25espressione in neuroni motori del mouse 10. Un diagramma schematico del test HCI è rappresentato in figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'elevata potenza di neurotossine botuliniche e la relativa facilità del loro militarizzazione ha portato nella loro classificazione come categoria A (priorità più alta) agenti biothreat dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie. Purtroppo, non ci sono FDA ha approvato terapie per contrastare BoNT intossicazione dopo la tossina è stato interiorizzato dai motoneuroni. Qualsiasi meccanismo di druggable che promuove il recupero neuronale da BoNT intossicazione potrebbe portare allo sv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X 100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
References
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