En hög halt Imaging analys för Identifiering av botulinneurotoxin hämmare
Summary
Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.
Abstract
Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.
Introduction
Bakterien Clostridium botulinum producerar Botulinum-neurotoxin, ett av de mest potenta biologiska gifter som människan känner till 1. Det finns 7 olika BoNT serotyper (BoNT / AG). BoNT / A-Gall inducerar förlamning vid den neuromuskulära förbindelsen på grund av SNARE komplexa proteolys 2,3. SNARE proteolys förhindrar signalsubstans blåsmembranfusion och därmed blockerar exocytos av neurotransmittorer 4. Den specifika SNARE målet beror på den speciella BoNT serotyp involverad i berusning processen. BoNT / A och BoNT / E klyver SNAP-25, medan BoNT / C klyver både SNAP-25 och syntaxin 5. Den återstående serotyper klyver synaptobrevin (även kallad Blås-associerat membranprotein (VAMP). BoNT / A valdes för metodutveckling eftersom den är ansvarig för en stor andel av naturligt förekommande botulism och har den längsta verkningstid 6. Utveckling av små molekyler terapier mot BoNT / A är ett viktigt mål förvår läkemedelsforskning programmet och har utnyttjat traditionella målrelaterade metoder för att identifiera aktiva site proteolytiska hämmare 7, 8-10. Dock kommer skapandet av aktiva site hämmare med bredspektrumaktivitet mot flera serotyper och efter exponering effekt sannolikt vara utmanande.
Vi har därför genomfört ett innovativt, fenotypisk läkemedelsframtagning metod som använder BoNT SNAP-25 klyvning som en funktionell endpoint för att identifiera små molekyler som kan blockera BoNT-medierad motorneuron berusning. SNAP-25 krävs för frisättningen av neurotransmittorer, såsom nedbrytning av SNAP-25 är förutsägande för paralys och letalitet in vivo. Till exempel kan cellbaserad screening leda till upptäckt av nya modulatorer av cellulära faktorer som är ansvariga för toxininaktivering eller hämning av toxin vägar inne målceller. En viktig faktor i fenotypisk analys utveckling är urvalet av fysiologiskt relevanta biologiska modeller. We och andra har beskrivits mus embryostam (ES) cellhärledda motomeuroner att rekapitulera den immunologiska karaktären av primära motoriska neuroner, inklusive uttryck av SNAP-25 11- 13. Viktigt är att dessa cellulära system är mycket känsliga för BoNT / A-förgiftning och demonstrera dosberoende spjälkning av SNAP-25 som svar på ökande koncentrationer av toxin 11,12. De differentierade motoriska nervceller produceras också i mängder som är tillräckliga för hög genomströmning platta baserad analys och tillåtet utformningen av en rad cellulära analyser.
Den fenotypiska analysen är en immunofluorescens metod som använder två olika antikroppar för att kvantifiera klyvning av endogent uttryckt fullängds SNAP-25 under BoNT / A rus av mus motorneuron kultur. En karboxylterminala BoNT / A klyvning känslig (BACS) antikropp som känner igen endast fullängds SNAP-25 gör det möjligt att bedöma BoNT / A förmedlad proteolys av SNAP-25expression i mus motomeuroner 10. Ett schematiskt diagram av det HCl-analysen visas i Figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den höga styrkan hos botulinneurotoxiner och relativt lätt att deras beväpning har resulterat i att dessa klassificeras som kategori A (högsta prioritet) biothreat agenter av amerikanska Centers for Disease Control and Prevention. Tyvärr finns det inga FDA godkända läkemedel för att motverka BoNT berusning efter toxinet har internaliseras av motoriska nervceller. Alla druggable mekanism som främjar neuronal återhämtning från BoNT berusning kan leda mot utvecklingen av en potentiell behandling för att skydda…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X 100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
References
- Lamanna, C. The most poisonous poison. Science. 130, 763-772 (1959).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
- Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin. Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).
- Yersin, A., et al. Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).
- Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).
- Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense. Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).
- Nuss, J. E., et al. Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies. Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).
- Opsenica, I., et al. A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus. Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).
- Opsenica, I., et al. The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease. European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).
- Nuss, J. E., et al. Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease. ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).
- Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem cell research. 6, 195-205 (2011).
- Pellett, S., et al. Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A. Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).
- McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).
- Fischer, A., et al. Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).
