Lamprey Reticulospinal Aksonlar Akut Ayrılma Bireysel Fonksiyonel Presinaptik Terminalleri Yayın Yüz Membranından Kayıt Enable

Summary

Recording Ca²⁺ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca²⁺ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Abstract

Sinaptik iletim son derece hızlı bir süreçtir. Aksiyon potansiyeli bırakma yüz zarında bulunan voltaj-kapılı kalsiyum kanalları (VGCCs) aracılığıyla, presinaptik terminale Ca ² akını tahrik, vezikül füzyon ve nörotransmitter salınımı için tetikleyici olduğunu. Sinaptik iletim süratine önemli aksiyon potansiyeli, VGCCs gelişi ve nörotransmitter bırakma makineler arasındaki mekansal ve zamansal senkron olduğunu. Doğrudan ca bireysel presinaptik terminallerin serbest yüz zardan ²⁺ akımları kaydetmek için yeteneği presinaptik Ca ^{2 +} ve nörotransmitter salınımı arasındaki ilişkinin kesin bir anlayış için şarttır. Elektrofizyolojik kayıt için presinaptik bırakma yüz zarına erişim çoğu hazırlıkları ve presinaptik Ca mevcut değildir ²⁺ giriş görüntüleme teknikleri ve makroskopik akım MeasureMe kullanılarak karakterize edilmiştirNTS – Ca ^{2 +} girişi görselleştirmek için yeterli zamansal çözünürlüğe sahip değilsiniz teknikleri. Doğrudan tek presinaptik terminallerinde VGCCs vasıflandırılması merkezi sinapslara mümkün olmamıştır ve bu güne kadar başarılı bir şekilde sadece civciv kılcal gangliyon çanak tipi sinaps ve sıçan kaliksler elde edilmiştir. Biz başarıyla postsinaptik yapıların yoksun fonksiyonel presinaptik terminalleri ile izole reticulospinal aksonlarını verir omuriliğin bir akut ayrışmış hazırlık geliştirerek taşemen omurilik dev reticulospinal sinaps bu sorunu ele alınmıştır. Biz floresan etiket ve bireysel presinaptik terminalleri belirlemek ve kayıt için onları hedef olabilir. Bu hazırlık kullanarak, immünohistokimya ve elektrofizyoloji yaklaşımlar kullanılarak tek tek presinaptik terminallerin serbest yüzünde doğrudan VGCCs tanımlanmıştır. Ca ^{2 +} akımları bırakma yüz zar o doğrudan kaydedilmiştirm bağımsız presinaptik terminalleri, birinci tür kayıt merkezi sinapslarda gerçekleştirilecektir.

Introduction

Sinaptik iletim son derece hızlı ve hassas bir işlemdir. Presinaptik terminalin etki potansiyeli istilası salma Yan membran, presinaptik Ca ^{2 +} artışım vezikül füzyon ve nöro-ileticinin salıverilmesine ¹ için tetikleyici olarak görev bulunan VGCCs açılmasına yol açar. Bu adımların hepsi mikrosaniye ² yüzlerce içinde meydana gelmektedir ve dolayısıyla vesikül füzyon makine ³ VGCCs sıkı uzamsal bağlanmasını gerektirir. Presinaptik Ca ^{2 +} akıları başlıca Ca ^{2 +} duyarlı boyalar kullanarak ⁴ yaklaşımlar görüntüleme ile karakterize edilmiştir. Presinaptik nöronların Ca ^{2 +} modüle eden bir araya getiren ^Ca +2 tamponları dolaylı olarak presinaptik sinir iletiminin kalsiyum ve ³ arasındaki ilişkiyi karakterize etmek için kullanılmaktadır. Ayrıca, Ca ^{2 + 5} uncaging veya macroscopi kaydederek presinaptik serbest Ca ^{2 +} konsantrasyonunu modüleCa c ^{2 +} akımları vezikül füzyon ve / veya salınımının önlemler ile birlikte kullanılmıştır; Bu kapasite ölçümleri gibi ⁶ veya postsinaptik tepkiler aynı soruyu ele ^2. Sinaptik vezikül füzyon ve nörotransmitter salınımını tetikleyerek ²⁺ akımlar Ancak, serbest yüzüne ²⁺ akımları doğrudan Ca karakterize, membran depolarizasyon Ca çevrilir presinaptik membranın özel bölümünde, Ca kesin bir ölçü elde ayrılmaz olduğunu ²⁺ sinaptik vezikül füzyon gereksinimi. Buna ek olarak, bununla doğrudan aksiyon potansiyelinin zamanla arasındaki zamanlama ilişkisinin tam aydınlatılması vezikül füzyon ve serbest doğru eş zamanlı ölçümleri ile karşılaştırın bağlanmış, tek tek presinaptik terminallerinde Ca ^{2 +} akımları karakterize etmek için, presinaptik Ca2 ⁺ akımı, vezikül füzyon ve bırakın. Salma Yan membran erişimpostsinaptik dendritler tarafından appozisyon kapatmak nedeniyle presinaptik terminalleri çoğunda mevcut değildir. Bireysel presinaptik terminallerde akımının doğrudan ölçümler önlediğinden Bu erişilememesi VGCCs karakterizasyonu önemli bir engel olmuştur. Bireysel presinaptik terminallerde presinaptik Ca ^{2 +} akımları doğrudan karakterizasyonu bugüne kadar merkezi sinapsların mümkün olmamıştır ve sadece iki kalisyel tipi presinaptik terminallerde elde edilmiştir; civciv siliyer ganglion ^7-10 ve sıçan kalikslerin ^11,12 çanak tipi sinaps. Taşemen omurilik ¹³ dev reticulospinal sinaps da dahil olmak üzere diğer tüm presinaptik terminallerde, presinaptik salınmasını yüz zara erişim eksikliği gibi Ca2 ⁺ akıları presinaptik incelemek için Ca ^{2 +} görüntüleme gibi doğrudan olmayan yaklaşımlar kullanılmasını gerektirmiştir.

<img alt="Şekil 1" fo: İçerik-width = "5in" src = "/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg" width = "500" />
Dorsolomber ventral bir yönlenmesine işaret eder taşemen omurilik Şekil 1. taşemen dev reticulospinal sinaps.: (A) kesiti. Reticulospinal aksonlar yeşil Asteriks ile işaretlenir. Postsinaptik nöronun ¹³ üzerine (yeşil oklarla işaretli) presinaptik reticulospinal akson passant kişileri en çok yapmak gösteren taşemen omurilikte reticulospinal sinaps (b) 3-D rekonstrüksiyonu. Postsinaptik nöron Alexa Fluor 568 hidrazitle (kırmızı) ile dolu olan ise presinaptik terminalleri, Alexa Fluor 488 hydrazide birleşmiş falloidin (yeşil) ile işaretlenmiş edilmiştir.

Nöron üzerine passant sinaptik bağlantıları tr omurilik Rostral-kaudal eksen Şekil 1a kordon paralel form birden ventral bölgesinde bulunan Lamprey dev reticulospinal akson,Spinal ventral boynuz ¹⁴ Şekil 1b ^13. Makroskopik tam hücreli Ca ^{2 +} akımları sağlıklı omurilik ^13,15 olarak reticulospinal aksonlarından kaydedildi. Ancak, Ca doğrudan ölçümde önceki kör girişimleri hücre bağlı yama kelepçe tekniği kullanılarak sağlam taşemen omurilikte reticulospinal akson ²⁺ akımlar nedeniyle karşıt süreçler postsinaptik nedeniyle presinaptik bırakma yüz membran ulaşamama ¹³ başarısız kanıtlanmış Şekil 1b. Zar daha önce serbest yüz, sinaps mekanik pertürbasyon önceden ¹² kayıt veya mekanik ayrılma ^16, ikiye katlanmış bir enzim tedaviye sinaptik sonrası nöronu ¹¹ çıkarılmasıyla ulaşılabilir hale getirilmiştir. Omurilik karmaşık organizasyonu göz önüne alındığında, postsinaptik nöron tespit ve mekanik bunu geri veya th perturb son derece zor olduğunu kanıtlayacake sinaps. Dolayısıyla, biz mekanik ayrılma ardından enzimatik tedavi ¹⁷ kullanmaya karar verdi.

Bu yaklaşımı kullanarak, böylelikle bireysel presinaptik terminallere sınırsız erişim sağlayan, herhangi bir postsinaptik süreçlerin yoksun fonksiyonel presinaptik terminalleri ile canlı izole reticulospinal aksonlarını verir taşemen omuriliğin bir akut ayrışmış hazırlık geliştirdik. Standart bir ters mikroskop ve flüoresan görüntüleme ile bağlantılı olarak, hücre-ile bir kayıt için, Ca ^{2 +} akımları Şekil 4C ve Şekil 4d izole bir kayıt çözeltisi içeren bir yama pipet ile tanımlama, ve bireysel floresan tanımlanan presinaptik terminalleri hedef sağlıyor ekli gerilim kelepçe tekniği. Ca ^{2 +} akımları tek tek presinaptik terminalleri Şekil 4f presinaptik bırakma yüz membran doğrudan kaydedildi. Bu, bir significaBu merkezi sinapslara gerçekleştirilebilir ilk bu tür kayıt olduğu nt sinaptik iletim alanında atılım.

Protocol

Poli-D-lisin hidrobromit hazırlanması 1. 0.1 M borat tamponda (pH 8.5) içerisinde 1 mg / mL poli-D-lisin hidrobromit hazırlayın. -20 ° C'de kısım ve mağaza. Lameller 2. Poli-lizin Kaplama Not: Bir laminer akış odasında tüm temizlik ve kaplama işlemleri yapınız. 2 saat süre ile, 1 N hidroklorik asit (HCl) içeren bir Petri tabağına yerleştirin lamelleri. Aspire tüm HCI ve% 70 Etanol (EtOH) 2-…

Representative Results

Bu ayrılma protokol verim sağlıklı ve fonksiyonel izole reticulospinal postsinaptik çıkıntılar Şekil2fde yoksun aksonları, ama yine de uyarılmış sinaptik vezikül ekzo-ve endositoz Şekil 4c ve 4d Şekil girebilen işlevsel presinaptik terminalleri muhafaza eder. Reticulospinal akson izole edilmiş bölgeleri bölümleri açık reticulospinal akson membran Şekil2fde serbest erişim sağlayan diğer herhangi bir nöronal işlemin aç?…

Discussion

Bizim ayrışma protokol postsinaptik projeksiyonlar Şekil2fde yoksun izole reticulospinal aksonlarını veren tarafından önemli, ama yine de fonksiyonel presinaptik terminalleri Şekil 4c ve Şekil 4d muhafaza edilmektedir. Presinaptik terminale karşı süreçler postsinaptik yokluğu daha önce, merkezi sinapsların mümkün ve başarılı bir şekilde sadece iki kalisyel-tipi presinaptik terminallerde elde değil tek presinaptik terminallerde presinaptik bırakma…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
0.2 µm syringe filter	EMD Millipore	SLGV004SL
22×60 mm coverslips	Fisherbrand	12545J
Advasep-7	Cydex Pharmaceuticals	ADV7
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379
Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen/Life Technologies	A21070
Antifreeze	Prestone
Boric acid	Sigma-Aldrich	B7660
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Bright field light source	Dolan-Jenner	Fiberlite 180
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
Collagenase Type IA from Cloristridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Cover slip	Fisher-Scientific	12-545-J
Dextrose	Sigma-Aldrich	D9559
Digital CCD Camera	Hamamatsu	C8484-03G01
Dissection fine forceps	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-20
Dissection microscope	Leica Biosystems	Leica MZ 12
Dissection scissors	Fine Science Tools	15025-10
Dissection scissors fine	Fine Science Tools	91500-09
Dissection scissors ultra fine	Fine Science Tools	15000-08
FM 1-43	Invitrogen/Life Technologies	T3163
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523
High vacuum grease	Dow-Corning
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA-56-500
Immersion oil	Fisher-Scientific	M2000
Industrial grade Nitrogen gas tank	Praxair	UN1066
Insect pins	Fine Science Tools	26002-10
Liquid suture glue	Braun Veterinary Cair Division	8V0305	The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M2670
Methanol	Sigma-Aldrich	154903
Non-fat dry milk	Cell Signaling Technology	9999S
P-87 Micropipette puller	Sutter Instruments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Perfusion pump	Cole-Palmer	Masterflex C/L
Petri dish 100×15 mm	Fisher-Scientific	875712
Petri dish 35×10 mm	Fisher-scientific	875712
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1024	MW > 300000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Primary antibodiesR-type calcium channel	Alomone Labs	ACC-006
Protease Type XIV from Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147
Scalpel blades	World Precision Instruments	500240
Schot Duran Preesure Bottle	Fisher-Scientific	09-841-006
Silicone tubing for glue application	Cole-Palmer	07625-26
Slicing base plate	Leica Biosystems	14046327404
Slicing chamber	Leica Biosystems	1.4046E+10
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide		S8045
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	B3545
Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 160	To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 184	To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight
Teflon coated forceps	Fine Science Tools	11626-11
Tricaine methanesulphonate	Sigma-Aldrich	A5040
Vibratome blades	World Precision Instruments	BLADES
Xenon lamp	Nikon