جيل من<em> الأمعائية</em> س. YSU Auxotrophs عن طريق الطفرات ينقول
Summary
الأمعائية س. YSU تنمو في الجلوكوز الحد الأدنى من الأملاح المتوسطة. يتم إنشاء Auxotrophs عن طريق تحويل ذلك مع transposome الذي إدراج نفسها عشوائيا في جينوم المضيف. تم العثور على المسوخ بواسطة الطلاء المتماثلة من المتوسطة معقد إلى الحد الأدنى من المتوسط. يتم تحديد جينات الانقاذ توقفت بسبب الجينات وتسلسلها.
Abstract
أنموذجية التغذي البكتيريا تنمو على M-9 الأملاح الحد الأدنى تستكمل المتوسطة مع الجلوكوز (M-9 المتوسطة)، والذي يستخدم كمصدر للكربون والطاقة. يمكن أن تتولد Auxotrophs باستخدام transposome. المتاحة تجاريا، TN 5 transposome -derived المستخدمة في هذا البروتوكول يتكون من شريحة خطي من الحمض النووي الذي يحتوي على R6K أصل النسخ γ، جين المقاومة الكانامايسين واثنين تسلسل الفسيفساء تنتهي، والتي تكون بمثابة ترانسبوزاز ملزمة المواقع. وtransposome، على النحو المنصوص عليه مجمع بروتين DNA / ترانسبوزاز، هو عرض بواسطة الصعق الكهربائي في سلالة بدئية الاغتذاء، الأمعائية س. YSU، ويشتمل على نفسها عشوائيا في جينوم هذا المضيف. Transformants هي نسخة مطلية على لوريا، Bertani أجار لوحات تحتوي على كانامايسين، (LB-اساسه) وعلى لوحات أجار M-9 متوسطة تحتوي على كانامايسين (M-9-اساسه). تعتبر transformants التي تنمو على لوحات LB-اساسه ولكن ليس على لوحات M-9-أن يكون اساسه auxotrophs. الجينومية النقىيتم هضم الحمض النووي من عوني التغذي جزئيا، و ligated وتحولت الى البير + الإشريكية القولونية (إي كولاي) سلالة. تكرار أصل R6Kγ يسمح البلازميد إلى تكرار في البير + E. سلالات القولونية، والمقاومة علامة كانامايسين تسمح لاختيار البلازميد. كل المحولة يمتلك البلازميد جديد يحتوي على ينقول يحيط بها المنطقة الكروموسومات انقطاع. سانجر تسلسل والأساسية المحلية محاذاة أداة البحث (انفجار) تشير إلى الهوية المفترضة من الجين توقف. هناك ثلاث مزايا لاستخدام هذه الاستراتيجية الطفرات transposome. أولا، أنها لا تعتمد على التعبير عن الجينات ترانسبوزاز من قبل المضيف. الثاني، هو عرض transposome إلى المضيف الهدف بواسطة الصعق الكهربائي، وليس عن طريق الاقتران أو عن طريق التنبيغ وبالتالي أكثر كفاءة. ثالثا: تكرار أصل R6Kγ يجعل من السهل تحديد تحور زالشم الذي تعافى جزئيا في البلازميد المؤتلف. هذه التقنية يمكن استخدامها للتحقيق في الجينات المسؤولة عن الخصائص الأخرى للالأمعائية س. YSU أو من مجموعة متنوعة من السلالات البكتيرية.
Introduction
أنموذجية التغذي البكتيريا تنمو في M-9 الأملاح التي تحتوي على الحد الأدنى من متوسط الجلوكوز (M-9 المتوسطة)، وتحويل الجلوكوز من خلال مسارات الأيض الكربون المركزية لتوليد السلائف، مثل الأحماض الأمينية، والأحماض النووية والفيتامينات، ل1 الحيوي. M-9 المتوسطة يحتوي على كلوريد الأمونيوم كمصدر النيتروجين والفوسفات والبوتاسيوم والصوديوم كمنطقة عازلة ومصدر الفوسفور، كبريتات المغنيسيوم كمصدر الكبريت والجلوكوز كمصدر للكربون والطاقة. لوريا، Bertani (LB) متوسطة غنية في الأحماض الأمينية من تريبتون والفيتامينات وعوامل النمو من خلاصة الخميرة. وهو يدعم نمو auxotrophs التي لا يمكن توليف الأحماض الأمينية والفيتامينات وعوامل النمو الأخرى المطلوبة للنمو على M-9 متوسطة. وبالتالي، سوف prototrophs تنمو في LB M-9 والمتوسطة، في حين auxotrophs سوف تنمو في LB المتوسطة ولكن ليس في M-9 متوسطة. من خلال تقديم الطفرات في عدد السكان بدئية الاغتذاء من البكتيريا وتحديد الجينات الطافرة التي تسبب الظواهر بعامل نمائي، هو بوssible للحصول على فهم أفضل لعملية الأيض في سلالة بكتيرية.
ويمكن استخدام ينقول الطفرات لتحديد العديد من الجينات المطلوبة للنمو على مستوى السكر في M-9 متوسطة. الترانسبوزونات إدراج نفسها عشوائيا في جينوم المضيف 2. قبل اكتشاف transformants ينقول على لوحات أجار LB نسخة والطلاء لهم على لوحات M-9 المتوسطة أجار، فمن الممكن للكشف عن auxotrophs. يتم تحديد جينات توقف من خلال إنقاذ الجينات. تستخدم هذه الدراسة متاحة تجاريا تينيسي 5 -derived transposome التي يتم شحنها كحل للشريحة الحمض النووي ينقول الخطي مختلطة مع البروتين ترانسبوزاز. قطاع DNA تفتقر إلى الجين ترانسبوزاز ولكن يحتوي على الجينات المقاومة الكانامايسين، وهو R6K تكرار γ المنشأ واثنين من الزخارف الفسيفسائية التي هي تسلسل الحمض النووي لترانسبوزاز ملزم في نهاية كل قطعة 3،4. منذ يتم إضافة بروتين ترانسبوزاز مباشر على الحمض النووي، والجزء الحمض النووي وحدهيعرف بأنه ينقول، ويعرف مجمع بروتين DNA / ترانسبوزاز باسم transposome. وحولت transposome بواسطة الصعق الكهربائي 5 إلى المضيف حساسة الكانامايسين (الشكل 1A). المستعمرات التي تنمو على لوحات أجار LB تحتوي على كانامايسين (LB-اساسه) لديها إدراج ينقول (الشكل 1B)، ونسخة مطلية transformants التي لا تنمو على M-9 لوحات المتوسطة أجار التي تحتوي على كانامايسين (M-9-اساسه) هي auxotrophs (Figire 1C). الحمض النووي الجيني من المسخ هو النقى ويهضم جزئيا مع 4-قاعدة تقييد القطع نوكلياز داخلية، الاتحاد البلغاري CI (الشكل 1D). يتم تحويل الحمض النووي و ligated الى سلالة من القولونية (إي كولاي) الذي يحتوي على الجينات البير (الشكل 1E). يسمح هذا الجين البلازميد جديد يحتوي على ينقول والمنطقة المحيطة الكروموسومات المضيفة لتكرار في E. القولونية 6. ويعمل هذا الجين المقاومة الكانامايسين مثلعلامة جدير بالانتخاب لالبلازميد الجديد. أخيرا، تسلسل باستخدام بادئات مكملة لبعضها نهاية ينقول والأساسية المحلية محاذاة أداة البحث (انفجار) 7،8 تحليل تسلسل الناتجة تستخدم لتحديد هوية الجينات توقف.
وتنص هذه الاستراتيجية transposome الطفرات ثلاث مزايا 3. أولا، لأن البروتين ترانسبوزاز لا بد مباشرة إلى ينقول، الإدراج لا يعتمد على التعبير عن الجينات ترانسبوزاز داخل المضيف. مرة واحدة يدمج ينقول نفسه في جينوم المضيف، مع تدهور ترانسبوزاز، ومنع حركة إضافية لينقول. ومع ذلك، حركة إضافية لا يمكن منعها إذا كان المضيف يمتلك الذاتية عنصرا transpositional تينيسي 5. ثانيا، إدخال transposome بواسطة الصعق الكهربائي يجعل من الممكن استخدامها في مجموعة واسعة من المضيفين. كما أنه يزيل الحاجة إلى إدخال ينقول طريق الاقتران البكتيري أو السادسإصابة راؤول. تتطلب كلتا العمليتين قابلية المضيف. ثالثا، إدراج الجينات المقاومة الكانامايسين وR6K تكرار γ الأصل في transposome يجعل من الاسهل لتحديد الجين توقف. المناطق ينقول انقطاع ويمكن تخزين والتسلسل كما البلازميدات، مما يلغي الحاجة إلى استخدام سلسلة رد فعل البلمرة العكسية (PCR) تقنية لتحديد الجينات.
بروتوكول المعروضة في هذا الفيديو يصف كل خطوة لينقول الطفرات من الأمعائية س. YSU 9 باستخدام transposome من عرضه في الخلايا البكتيرية إلى تحديد الجين المفترض أنها توقفت. بالإضافة إلى البروتوكولات نشرت سابقا 3،4،10، يتم عرض طرق مفصلة لاستخدام الطلاء طبق الأصل للكشف عن auxotrophs. ويمكن استخدام هذه التقنية الطفرات عن التحقيق في الظواهر الأخرى، مثل المضادات الحيوية والمعادن المقاومة، في أنواع مختلفة من البكتيريا، لIDENTifying عدد ضئيل من الجينات المطلوبة للنمو في ظل ظروف ثقافة المحددة في دراسات علم الأحياء الاصطناعية، أو لتعليم عنصرا مختبر لعلم الوراثة أو علم وظائف الأعضاء بالطبع الميكروبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطفرات ينقول باستخدام transposome هي أداة فعالة لتوليد auxotrophs في الأمعائية س. YSU وأنواع أخرى من غرام سلبي وغرام البكتيريا إيجابية 3،4. وقد بدأت هذه العملية عن طريق إدخال transposome -derived تينيسي 5 إلى المضيف بواسطة الصعق الكهربائي. لتحديد المستعمرات مع تدرج، وكان ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود الكاتب أن أشكر كل من بلدي الجامعية المستقلة طلاب البحوث وكل من بلدي الميكروبية الفسيولوجيا طلاب الدراسات العليا الذي اختبر أفكاري ينقول الطفرات خلال فصول الربيع 2010-2014. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل قسم العلوم البيولوجية في جامعة ولاية يانجز.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS – Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
- Kim, B. H., Gadd, G. M. . Bacterial physiology and metabolism. , (2008).
- Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
- Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).
- Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
- Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
- Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
- Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
- Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
- Ausubel, F., Brent, R., et al. . Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).
- Miller, J. H. . A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).
- Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
- Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
- Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
- Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
- Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
- Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).
