की पीढ़ी<em> Enterobacter</em> सपा. YSU Auxotrophs transposon mutagenesis का उपयोग
Summary
Enterobacter सपा. YSU ग्लूकोज न्यूनतम लवण माध्यम में होती है. Auxotrophs बेतरतीब ढंग से मेजबान जीनोम में ही सम्मिलित करता है जो एक transposome साथ यह बदलने से उत्पन्न कर रहे हैं. म्यूटेंट न्यूनतम मध्यम करने के लिए जटिल मध्यम से प्रतिकृति चढ़ाना से पाए जाते हैं. बाधित जीन जीन बचाव और अनुक्रमण द्वारा पहचाने जाते हैं.
Abstract
Prototrophic बैक्टीरिया एक कार्बन और ऊर्जा स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जाता है जो मध्यम ग्लूकोज (एम -9 मध्यम) के साथ पूरक एम -9 न्यूनतम लवण, पर बढ़ता है. Auxotrophs एक transposome का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, तमिलनाडु 5 व्युत्पन्न transposome transposase बाध्यकारी साइटों के रूप में सेवा है, जो एक R6K γ प्रतिकृति मूल, केनामाइसिन प्रतिरोध और दो मोज़ेक अनुक्रम समाप्त होता है के लिए एक जीन युक्त डीएनए के एक रेखीय खंड के होते हैं. एक डीएनए / transposase प्रोटीन परिसर के रूप में प्रदान की transposome, prototrophic तनाव, Enterobacter सपा में electroporation द्वारा शुरू की है. YSU, और बेतरतीब ढंग से इस मेजबान के जीनोम में खुद को शामिल किया. Transformants केनामाइसिन, (लेग-कान) युक्त प्लेटों अगर Luria-Bertani पर चढ़ाया प्रतिकृति और केनामाइसिन (एम-9-कान) युक्त एम -9 मध्यम अगर प्लेटों पर हैं. एम-9-कान प्लेटों पर लेग-कान प्लेटों पर बढ़ने नहीं बल्कि कि transformants auxotrophs माना जाता है. शुद्ध जीनोमिकएक auxotroph से डीएनए आंशिक रूप से पचा एक पीर + Escherichia कोलाई (ई कोलाई) तनाव में ligated और तब्दील हो जाता है. R6Kγ प्रतिकृति मूल प्लाज्मिड पीर + ई में दोहराने के लिए अनुमति देता है कोलाई उपभेदों, और केनामाइसिन प्रतिरोध मार्कर प्लाज्मिड चयन के लिए अनुमति देता है. प्रत्येक transformant बाधित गुणसूत्र क्षेत्र से घिरे transposon युक्त एक नया प्लाज्मिड के पास. सेंगर अनुक्रमण और बेसिक स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) बाधित जीन की एक ख्यात पहचान सुझाव है. इस transposome उत्परिवर्तजनन रणनीति का उपयोग करने के लिए तीन फायदे हैं. सबसे पहले, यह मेजबान द्वारा एक transposase जीन की अभिव्यक्ति पर भरोसा नहीं करता. दूसरा, transposome electroporation द्वारा, बजाय विकार से या पारगमन से लक्ष्य मेजबान में पेश किया है और इसलिए अधिक कुशल है. तीसरा, R6Kγ प्रतिकृति मूल यह आसान उत्परिवर्तित जी की पहचान करने के लिए बनाता हैआंशिक रूप से एक पुनः संयोजक प्लाज्मिड में बरामद किया है जो ईन. इस तकनीक Enterobacter सपा की अन्य विशेषताओं में शामिल जीनों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. YSU या जीवाणु उपभेदों की एक व्यापक विविधता की.
Introduction
Prototrophic बैक्टीरिया जैवसंश्लेषण 1 के लिए, अमीनो एसिड, न्यूक्लिक एसिड और विटामिन के रूप में व्यापारियों, उत्पन्न करने के लिए केंद्रीय कार्बन चयापचय रास्ते के माध्यम से ग्लूकोज में परिवर्तित करने, मध्यम ग्लूकोज (एम -9 मध्यम) युक्त एम -9 न्यूनतम लवण में हो जाना. एम -9 मध्यम एक कार्बन और ऊर्जा स्रोत के रूप में एक सल्फर स्रोत और ग्लूकोज के रूप में एक बफर और फॉस्फोरस स्रोत, मैग्नीशियम सल्फेट के रूप में एक नाइट्रोजन स्रोत, सोडियम और पोटेशियम फॉस्फेट के रूप में अमोनियम क्लोराइड होता है. Luria-Bertani (पौंड) मध्यम tryptone से और खमीर निकालने से विटामिन और वृद्धि कारकों में अमीनो एसिड में समृद्ध है. यह एम -9 माध्यम पर विकास के लिए आवश्यक अमीनो एसिड, विटामिन और अन्य विकास कारकों को संश्लेषित नहीं कर सकते हैं कि auxotrophs के विकास का समर्थन करता है. Auxotrophs एम -9 माध्यम में लेग माध्यम में नहीं बल्कि बढ़ेगा जबकि इस प्रकार, prototrophs, पौंड और एम -9 माध्यम में विकसित होगा. Auxotrophic phenotypes कारण है कि उत्परिवर्तित जीन बैक्टीरिया की एक prototrophic जनसंख्या में म्यूटेशन शुरू करने और पहचान करके, यह पो हैएक बैक्टीरियल तनाव में चयापचय की एक बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए ssible.
Transposon उत्परिवर्तजनन एम -9 मध्यम में ग्लूकोज पर विकास के लिए आवश्यक जीन के कई की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Transposons मेजबान जीनोम 2 में बेतरतीब ढंग से खुद को डालें. एम -9 मध्यम अगर प्लेटों पर लेग अगर प्लेटों और उन्हें चढ़ाना प्रतिकृति पर transposon transformants खोलना करके, यह auxotrophs लिए स्क्रीन के लिए संभव है. बाधित जीन जीन बचाव के माध्यम से पहचाने जाते हैं. इस अध्ययन के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तमिलनाडु 5 transposase प्रोटीन के साथ मिश्रित एक रेखीय transposon डीएनए खंड की एक समाधान के रूप में भेज दिया है जो transposome व्युत्पन्न का उपयोग करता है. डीएनए खंड एक transposase जीन का अभाव है लेकिन केनामाइसिन प्रतिरोध के लिए एक जीन, एक R6K γ प्रतिकृति मूल और खंड 3,4 के प्रत्येक के अंत में बाध्यकारी transposase के लिए डीएनए दृश्यों रहे हैं जो दो मोज़ेक रूपांकनों शामिल हैं. Transposase प्रोटीन डीएनए, अकेले डीएनए खंड को सीधे जोड़ा जाता है के बाद सेtransposon के रूप में परिभाषित किया गया है, और डीएनए / transposase प्रोटीन जटिल transposome के रूप में परिभाषित किया गया है. transposome एक केनामाइसिन संवेदनशील मेजबान (चित्रा 1 ए) में electroporation के 5 से बदल रहा है. केनामाइसिन (लेग-कान) युक्त लेग अगर प्लेटों पर बढ़ने कि कालोनियों केनामाइसिन (एम-9-कान) auxotrophs हैं युक्त एम -9 मध्यम अगर प्लेटों पर विकसित करने के लिए असफल कि transposon सम्मिलित (चित्रा 1 बी), और प्रतिकृति चढ़ाया transformants (Figire है 1 सी). एक उत्परिवर्ती से जीनोमिक डीएनए शुद्ध और आंशिक रूप से 4 आधार काटने प्रतिबंध endonuclease, Bfu सीआई (चित्रा -1) से पच जाता है. ligated डीएनए कि पीर जीन (चित्रा 1E) शामिल Escherichia कोलाई (ई कोलाई) के एक तनाव में तब्दील हो जाता है. इस जीन नई प्लाज्मिड transposon युक्त और ई में दोहराने के लिए मेजबान गुणसूत्र क्षेत्र flanking की अनुमति देता है कोलाई 6. केनामाइसिन प्रतिरोध जीन के रूप में कार्य करता हैनई प्लाज्मिड के लिए electable मार्कर. अंत में, बाधित जीन की पहचान निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है transposon और जिसके परिणामस्वरूप अनुक्रम का बेसिक स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) विश्लेषण 7,8 के प्रत्येक के अंत करने के लिए पूरक प्राइमर का उपयोग अनुक्रमण.
इस transposome उत्परिवर्तजनन रणनीति तीन फायदे 3 प्रदान करता है. Transposase प्रोटीन transposon को सीधे ही है, क्योंकि सबसे पहले, प्रविष्टि मेजबान भीतर transposase जीन की अभिव्यक्ति पर निर्भर नहीं करता है. Transposon मेजबान जीनोम में खुद को शामिल करने के बाद, transposase transposon के अतिरिक्त आंदोलन को रोकने, अपमानित किया जाता है. मेजबान एक अंतर्जात तमिलनाडु 5 transpositional तत्व के पास हालांकि, अगर अतिरिक्त आंदोलन रोका नहीं जा सकता. दूसरा, electroporation द्वारा transposome का परिचय यह संभव मेजबानों की एक विस्तृत विविधता में इसका इस्तेमाल करने के लिए बनाता है. यह भी बैक्टीरियल विकार से या छठी से transposon शुरू करने की आवश्यकता समाप्तRAL संक्रमण. दोनों प्रक्रियाओं मेजबान संवेदनशीलता की आवश्यकता है. तीसरा, केनामाइसिन प्रतिरोध जीन और transposome में R6K γ प्रतिकृति मूल के शामिल किए जाने के लिए यह आसान बाधित जीन की पहचान करने के लिए बनाता है. Transposon बाधित क्षेत्रों संग्रहीत और जीन की पहचान के लिए उलटा पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) तकनीक का उपयोग करने की आवश्यकता को समाप्त, प्लास्मिड के रूप में अनुक्रम किया जा सकता है.
इस वीडियो में प्रस्तुत प्रोटोकॉल Enterobacter सपा के transposon mutagenesis के लिए हर कदम का वर्णन करता है. YSU 9 यह बाधित ख्यात जीन की पहचान करने के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं में इसकी शुरूआत से एक transposome का उपयोग. पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 3,4,10 के अलावा, auxotrophs लिए स्क्रीन के लिए प्रतिकृति चढ़ाना प्रयोग करने के लिए विस्तृत तरीकों प्रस्तुत कर रहे हैं. इस उत्परिवर्तजनन तकनीक अध्यक्ष के लिए, बैक्टीरिया के विभिन्न प्रकारों में, इस तरह के एंटीबायोटिक और धातु प्रतिरोध के रूप में अन्य phenotypes, की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या एक आनुवंशिकी या सूक्ष्म शरीर क्रिया विज्ञान पाठ्यक्रम की एक प्रयोगशाला घटक को पढ़ाने के लिए सिंथेटिक जीव विज्ञान के अध्ययन में परिभाषित संस्कृति शर्तों के तहत विकास के लिए आवश्यक जीन की न्यूनतम संख्या ifying.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक transposome का उपयोग transposon उत्परिवर्तजनन Enterobacter सपा में auxotrophs पैदा करने के लिए एक कुशल उपकरण है. YSU और ग्राम नकारात्मक अन्य प्रकार के और ग्राम सकारात्मक बैक्टीरिया 3,4. प्रक्रिया electroporation द्वारा होस्ट में तमि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक 2010-2014 वसंत सेमेस्टर के दौरान मेरे transposon mutagenesis के विचारों का परीक्षण किया जो मेरे माइक्रोबियल फिजियोलॉजी स्नातक छात्रों के मेरे स्नातक स्वतंत्र रिसर्च छात्रों के सभी और सभी को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम Youngstown राज्य विश्वविद्यालय में जीव विज्ञान विभाग द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS – Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
- Kim, B. H., Gadd, G. M. . Bacterial physiology and metabolism. , (2008).
- Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
- Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).
- Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
- Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
- Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
- Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
- Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
- Ausubel, F., Brent, R., et al. . Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).
- Miller, J. H. . A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).
- Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
- Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
- Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
- Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
- Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
- Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).
