Generazione di<em> Enterobacter</em> Sp. YSU auxotrofi Utilizzando Transposon Mutagenesi
Summary
Enterobacter sp. YSU cresce in glucosio sali minima quantità di terreno. Auxotrofi sono generati trasformandola con transposome che si inserisce in modo casuale nel genoma dell'ospite. Mutanti si trovano di replicazione delle piastre da medie complesso terreno minimo. Geni interrotti sono identificati da salvataggio e sequenziamento del gene.
Abstract
Prototrofici batteri crescono su M-9 sali minimi mezzo addizionato con glucosio (M-9 medio), che viene utilizzato come fonte di carbonio e di energia. Auxotrofi possono essere generati utilizzando un transposome. Il commercialmente disponibile, Tn 5 transposome -derived utilizzato in questo protocollo è costituito da un segmento lineare di DNA contenente una origine di replicazione γ R6K, un gene per la resistenza alla kanamicina e termina due sequenze mosaico, che servono come siti di legame trasposasi. Il transposome, fornito come un complesso proteico DNA / trasposasi, viene introdotta mediante elettroporazione nel ceppo prototrofici, Enterobacter sp. YSU, e si inserisce in modo casuale nel genoma di questo host. I trasformanti sono placcati in replica su Luria-Bertani agar piastre contenenti kanamicina, (LB-kan) e su piastre di agar M-9 medie contenenti kanamicina (M-9-kan). I trasformanti che crescono su piastre LB-kan, ma non su piastre M-9-kan sono considerati auxotrofi. Genomico purificatoDNA da un auxotroph è parzialmente digerito, legata e trasformato in un pir + Escherichia coli (E. coli) ceppo. L'origine di replicazione R6Kγ permette il plasmide di replicare in pir + E. ceppi di coli, e il marcatore di resistenza alla kanamicina consente per la selezione plasmide. Ogni trasformante possiede un nuovo plasmide contenente il trasposone affiancato dalla regione cromosomica interrotto. Sanger sequenziamento e il Local Alignment Search Tool di base (BLAST) suggeriscono una identità putativo del gene interrotto. Ci sono tre vantaggi nell'utilizzo di questa strategia mutagenesi transposome. In primo luogo, non si basa sulla espressione di un gene trasposasi dall'host. In secondo luogo, il transposome viene introdotto nel host di destinazione mediante elettroporazione, piuttosto che per coniugazione o trasduzione e quindi è più efficiente. In terzo luogo, l'origine di replicazione R6Kγ rende facile identificare il g mutatoene che è parzialmente recuperato in un plasmide ricombinante. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare i geni coinvolti nelle altre caratteristiche di Enterobacter sp. YSU o di una più ampia varietà di ceppi batterici.
Introduction
Prototrofici batteri crescono in M-9 sali minimi terreno contenente glucosio (M-9 medio), la conversione del glucosio attraverso percorsi metabolici carbonio centrali per generare precursori, come amminoacidi, acidi nucleici e vitamine, per biosintesi 1. M-9 terreno contiene cloruro di ammonio come fonte di azoto, sodio e fosfato di potassio come buffer e fonte di fosforo, solfato di magnesio come fonte di zolfo e glucosio come fonte di carbonio e di energia. Luria-Bertani (LB) mezzo è ricco di aminoacidi da tryptone e di vitamine e fattori di crescita da estratto di lievito. Esso supporta la crescita di auxotrofi che non possono sintetizzare aminoacidi, vitamine e altri fattori di crescita necessari per la crescita su M-9 medie. Così, prototrofi cresceranno in LB e M-9 medie, che auxotrofi cresceranno in terreno LB ma non in M-9 medie. Con l'introduzione di mutazioni in una popolazione prototrofici di batteri e di identificare geni mutati che causano fenotipi auxotrofi, è possible per ottenere una migliore comprensione del metabolismo in un ceppo batterico.
Transposon mutagenesi può essere utilizzato per identificare molti dei geni necessari per la crescita su glucosio nel M-9 medie. I trasposoni si inseriscono in modo casuale nel genoma dell'ospite 2. Individuando trasformanti trasposoni su piastre di agar LB e replica li placcatura su piastre M-9 agar, è possibile selezionare per auxotrofi. Geni interrotti sono identificati attraverso il salvataggio del gene. Questo studio utilizza un Tn disponibile in commercio 5 -derived transposome che viene fornito come una soluzione di un segmento di DNA trasposone lineare mescolato con proteine trasposasi. Il segmento di DNA manca un gene trasposasi, ma contiene un gene per la resistenza alla kanamicina, una origine di replicazione γ R6K e due motivi mosaico che sono sequenze di DNA per trasposasi vincolanti a ciascuna estremità del segmento 3,4. Poiché la proteina trasposasi viene aggiunto direttamente al DNA, il segmento di DNA da solodefinito come il trasposone, e il complesso proteico DNA / trasposasi è definito come il transposome. Il transposome viene trasformato mediante elettroporazione 5 in un kanamicina ospitante sensibile (Figura 1A). Le colonie che crescono su piastre di agar LB contenenti kanamicina (LB-kan) hanno inserti di trasposoni (Figura 1B), e replica placcato trasformanti che non riescono a crescere su M 9-piastre di agar contenenti kanamicina (M-9-kan) sono auxotrofi (Figire 1C). DNA genomico da un mutante è purificata e parzialmente digerito con 4-base restrizione taglio endonucleasi, BFU CI (Figura 1D). Il DNA ligato si trasforma in un ceppo di Escherichia coli (E. coli) che contiene il gene pir (Figura 1E). Questo gene permette il nuovo plasmide contenente il trasposone e fiancheggiante regione cromosomica ospite di replicare in E. coli 6. Il gene di resistenza alla kanamicina funge damarcatore eleggibile per il nuovo plasmide. Infine, sequenziamento usando primers complementari a ciascuna estremità del trasposone e Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Analisi 7,8 della sequenza risultante viene utilizzata per determinare l'identità dei geni interrotti.
Questa strategia transposome mutagenesi offre tre vantaggi 3. In primo luogo, poiché la proteina trasposasi è legato direttamente al trasposone, inserimento non dipende espressione del gene trasposasi all'interno dell'ospite. Una volta che il trasposone in sé incorpora nel genoma dell'ospite, la trasposasi è degradato, impedendo il movimento addizionale del trasposone. Tuttavia, il movimento supplementare non può essere evitata se l'host possiede un elemento endogeno Tn 5 traspositivo. In secondo luogo, l'introduzione del transposome mediante elettroporazione permette di utilizzarlo in un'ampia varietà di ospiti. Inoltre, elimina la necessità di introdurre il trasposone per coniugazione batterica o viinfezione ral. Entrambi i processi richiedono suscettibilità dell'ospite. Terzo, l'inserimento del gene per la resistenza alla kanamicina e l'origine di replicazione γ R6K nel transposome rende più facile identificare il gene interrotto. Regioni trasposone-interrotto possono essere memorizzati e sequenziati come plasmidi, eliminando la necessità di utilizzare la reazione a catena della polimerasi inversa (PCR) per l'identificazione del gene.
Il protocollo presentato in questo video descrive ogni passo per trasposone mutagenesi di Enterobacter sp. YSU 9 utilizzando un transposome dalla sua introduzione nelle cellule batteriche per l'identificazione del gene putativo è interrotto. Oltre ai protocolli precedentemente pubblicati 3,4,10, metodi dettagliati per l'utilizzo di replicazione delle piastre per lo screening auxotrofi sono presentati. Questa tecnica di mutagenesi possono essere utilizzate per indagare altri fenotipi, quali antibiotici e metallo resistenze, in diversi tipi di batteri, per identcando il numero minimo di geni necessari per la crescita in condizioni di coltura definiti in studi di biologia sintetica, o per l'insegnamento di un componente di un laboratorio di genetica o corso di fisiologia microbica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagenesi trasposone utilizzando un transposome è uno strumento efficace per la generazione di auxotrofi in Enterobacter sp. YSU e altri tipi di Gram-negativi e batteri Gram-positivi 3,4. Il processo è stato avviato con l'introduzione della Tn 5 transposome -derived nell'ospite mediante elettroporazione. Per identificare colonie con inserti, il ceppo di destinazione non trasformata doveva essere sensibili alla kanamicina per la selezione per il marcatore di resistenza portata dal …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'autore desidera ringraziare tutta la mia laurea di Ricerca Indipendente Studenti e tutti i miei microbica Fisiologia studenti laureati che hanno testato le mie idee trasposone mutagenesi durante i semestri di primavera 2010-2014. Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento di Scienze Biologiche presso Youngstown State University.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS – Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
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