Создание<em> Enterobacter</em> Зр. ЕГУ ауксотрофов Использование транспозонный мутагенез
Summary
Enterobacter зр. ЕГУ растет в глюкозе минимальную солевую среду. Ауксотрофов генерируются путем преобразования его с transposome которые случайно вставляет себя в геном хозяина. Мутанты найден реплик из сложной среды в минимальной среде. Прерванный гены обозначаются гена спасения и секвенирования.
Abstract
Прототрофных бактерии растут на М-9 минимальную солевую среду, дополненную глюкозы (М-9 среде), который используется в качестве источника углерода и энергии. Ауксотрофов могут быть получены с использованием transposome. Коммерчески доступны, Tn 5 -derived transposome используется в данном протоколе состоит из линейного сегмента ДНК, содержащей γ начала репликации R6K, ген устойчивости к канамицину и две мозаики последовательности концах, которые служат в качестве сайтов связывания транспозазу. Transposome, предоставляется в качестве белкового комплекса ДНК / транспозазы, вводится путем электропорации в прототрофных в штамме Enterobacter, уд. ЕГУ, и случайным образом включает себя в геном этого хозяина. Трансформанты реплика была помещена на Лурии-Бертани агаром, содержащих канамицин, (LB-KAN) и с агаром, М-9-среды, содержащей канамицин (M-9-KAN). Трансформанты, которые растут на LB-кан пластин, но не на M-9-кан пластин считаются ауксотрофы. Очищенная геномнаяДНК из ауксотроф частично переваривается, лигирована и преобразован в PIR + кишечной палочки (E.coli) штамма. Репликация Происхождение R6Kγ позволяет плазмиды повторить в PIR + E. штаммы кишечной палочки, а также резистентность к канамицину маркер позволяет выбрать плазмиды. Каждый трансформант обладает новую плазмиду, содержащую транспозона фланкированную прерванного хромосомной области. Сэнгер секвенирования и Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) предложить предполагаемый личность прерванной гена. Есть три преимущества использования этой transposome стратегию мутагенеза. Во-первых, она не зависит от экспрессии гена транспозазы хостом. Во-вторых, transposome вводится в целевом узле путем электропорации, а не путем конъюгации или трансдукции и, следовательно, является более эффективным. В-третьих, репликация происхождение R6Kγ позволяет легко идентифицировать мутантный ген, который частично восстановлены в рекомбинантной плазмиде. Этот метод может быть использован, чтобы исследовать гены, участвующие в других характеристик Enterobacter SP. ЕГУ или более разнообразных бактериальных штаммов.
Introduction
Прототрофных бактерии растут в М-9 минимальную солевую среду, содержащую глюкозу (М-9 среде), превращение глюкозы через центральные путей метаболизма углерода генерировать предшественники, такие как аминокислот, нуклеиновых кислот и витамины, для биосинтеза 1. М-9 среда содержит хлорид аммония в качестве источника азота, натрия и фосфат калия в качестве буфера и источника фосфора, сульфата магния в качестве источника серы и глюкозы в качестве источника углерода и энергии. Лурия-Bertani (LB) среда богата аминокислотами из триптона и в витаминах и ростовых факторов из дрожжевого экстракта. Он поддерживает рост ауксотрофов, что не может синтезировать аминокислоты, витамины и другие факторы роста, необходимые для роста на М-9 среде. Таким образом, прототрофов вырастет в LB и М-9 среде, в то время как ауксотрофы вырастет в LB среде, но не в М-9 среде. Вводя мутации в прототрофным популяции бактерий и идентификации мутантных генов, которые вызывают ауксотрофные фенотипы, это роssible, чтобы получить лучшее представление о метаболизме в бактериальном штамме.
Транспозонов мутагенез может быть использован для идентификации многих генов, необходимых для роста на глюкозе в М-9 среде. Транспозоны включить себя случайно в геном хозяина 2. К пятнистость транспозона трансформантов на LB чашках с агаром и их реплик на М-9 средних чашках с агаром, можно показать на экране для ауксотрофов. Прерванный гены идентифицированы через гена спасения. Это исследование использует имеющиеся в продаже Tn 5 -derived transposome который поставляется в качестве решения линейного сегмента транспозонов ДНК смешивается с транспозазы белка. Сегмент ДНК отсутствует ген транспозазы, но содержит ген устойчивости к канамицину, на γ начала репликации R6K и две мозаичные мотивы, которые Последовательности ДНК для связывания транспозазы на каждом конце сегмента 3,4. Поскольку белок транспозаза добавляют непосредственно к ДНК, ДНК-фрагмента в одиночкуопределяется как транспозона, и белковый комплекс ДНК / транспозаза определяется как transposome. Transposome преобразуется путем электропорации в 5 чувствительного к канамицину хоста (фиг.1А). Колонии, которые растут на чашках с агаром LB, содержащей канамицин (LB-кан) имеют транспозона вставок (рис 1б), и реплики покрытием трансформантов, которые не расти на М-9 средних пластин агара, содержащей канамицин (М-9-кан) являются ауксотрофы (Figire 1С). Геномную ДНК из мутанта очищают и частично переваривают с 4-щелочного рестрикции эндонуклеазы резки, BFU CI (рис 1D). Сшита ДНК трансформируют в штамм Escherichia coli (E.coli), который содержит ген PIR (рис 1E). Этот ген позволяет новую плазмиду, содержащую транспозона и фланговые области хромосомы хозяина для репликации в E. палочка 6. Ген устойчивости к канамицину служит в качествеelectable маркер для новой плазмиды. Наконец, секвенирования с использованием праймеров, комплементарных каждом конце транспозонов и Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) анализа 7,8 полученной последовательности используются для определения идентичности прерванной генов.
Эта стратегия transposome мутагенеза обеспечивает три преимущества 3. Во-первых, так как этот белок связывается транспозаза непосредственно к транспозона, вставка не зависит от экспрессии гена транспозазы в хосте. После того, как транспозона включает себя в геном хозяина, транспозаза ухудшается, предотвращая дополнительное движение транспозона. Однако, дополнительное движение не может быть предотвращено, если хост имеет эндогенный Tn 5 транспозиционные элемент. Во-вторых, введение transposome путем электропорации дает возможность использовать его в различных хостов. Это также устраняет необходимость введения транспозон бактериальной конъюгации или В.И.RAL инфекция. Оба процесса требуют восприимчивость хозяина. В-третьих, включение гена устойчивости к канамицину и γ репликации происхождения R6K в transposome делает его легче идентифицировать прерванный ген. Транспозона-прерывается регионы могут быть сохранены и секвенировали как плазмиды, устраняя необходимость использования обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации генов.
Протокол, представленные в этом видео описывается каждый шаг для транспозонов мутагенеза Enterobacter зр. ЕГУ 9 использованием transposome от его введения в бактериальных клеток к идентификации предполагаемого гена он прервал. В дополнение к ранее опубликованным протоколам 3,4,10, подробные способы использования реплик для скрининга ауксотрофов представлены. Эта техника мутагенеза может быть использован для исследования других фенотипы, например, антибиотиков и металлических сопротивлений, в различных видов бактерий, для идентifying минимальное число генов, необходимых для роста при определенных условиях культивирования в синтетических исследований биологии, или для обучения лабораторный компонентом генетики или микробной физиологии конечно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Транспозонов мутагенеза, используя transposome является эффективным инструментом для создания ауксотрофов в Enterobacter зр. ЕГУ и других видов грамотрицательных и грамположительных бактерий 3,4. Процесс был инициирован введения Tn 5 -derived transposome в хозяина путем электропорации. Д…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор хотел бы поблагодарить всех моих студентов Независимый исследовательский студентов и всех моих Микробная физиологии аспирантов, протестированных мои транспозонов мутагенеза идеи в течение 2010-2014 весенних семестра. Эта работа финансировалась Департаментом биологических наук в государственном университете Янгстауна.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS – Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
- Kim, B. H., Gadd, G. M. . Bacterial physiology and metabolism. , (2008).
- Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
- Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).
- Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
- Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
- Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
- Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
- Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
- Ausubel, F., Brent, R., et al. . Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).
- Miller, J. H. . A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).
- Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
- Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
- Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
- Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
- Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
- Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).
