Generering av<em> Enterobacter</em> Sp. YSU auxotrofer Använda transposonmutagenes
Summary
Enterobacter sp. YSU växer i glukosminimalt saltmedium. Auxotrofer genereras genom att transformera den med en transposome som slumpvis infogar sig själv in i värdgenomet. Mutanter hittas av replica plating från komplext medium till minimalmedium. Avbrutna gener identifieras genom gen räddning och sekvensering.
Abstract
Prototrofa bakterier växa på M-9 minimala saltmedium kompletterat med glukos (M-9 medium), som används som en kol- och energikälla. Auxotrofer kan genereras med en transposome. Den kommersiellt tillgängliga, Tn 5 härrörande transposome används i detta protokoll består av ett linjärt segment av DNA som innehåller en R6K γ replikationsursprung, en gen för kanamycinresistens och två mosaik sekvens slutar, som tjänar som transposas bindningsställen. Den transposome, tillhandahålls som en DNA / transposas proteinkomplex, inleds med elektroporering i prot stammen, Enterobacter sp. YSU, och innehåller i sig slumpmässigt i denna värd genom. Transformanter är replika ströks ut på Luria-Bertani-agar innehållande kanamycin (LB-kan) och upp på M-9 medel agarplattor innehållande kanamycin (M-9-kan). De transformanter som växer på LB-Kan-plattor men inte på M-9-Kan skyltar anses vara auxotrofer. Renat genomisktDNA från en auxotrof delvis smält, ligeras och transformeras till en pir + Escherichia coli (E. coli) stam. Den R6Kγ replikationsursprung tillåter plasmiden att replikera i pir + E. coli-stammar och den kanamycin-resistensmarkör möjliggör plasmiden val. Varje transformant besitter en ny plasmid som innehåller transposonen flankerad av den avbrutna kromosomal region. Sanger-sekvensering och Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) tyder på en förmodad identitet den avbrutna genen. Det finns tre fördelar med att använda denna transposome mutagenes strategi. Först förlitar sig inte på uttrycket av en transposas-gen av värden. För det andra är transposome införes i målvärden genom elektroporering, snarare än genom konjugation eller genom transduktion och därför är mer effektiva. För det tredje gör R6Kγ replikeringsursprunget det lätt att identifiera den muterade g-en som delvis utvinnes i en rekombinant plasmid. Denna teknik kan användas för att undersöka de som är involverade i andra egenskaper hos Enterobacter sp gener. YSU eller av ett större antal olika bakteriestammar.
Introduction
Prototrofa bakterier växa i M-9 minimala saltmedium innehållande glukos (M-9 medium), omvandling av glukos via centrala kol metabolismvägar för att generera prekursorer, såsom aminosyror, nukleinsyror och vitaminer, för biosyntes 1. M-9 medium innehåller ammoniumklorid som kvävekälla, natrium- och kaliumfosfat som buffert och fosforkälla, magnesiumsulfat som en svavelkälla och glukos som en kol- och energikälla. Luria-Bertani (LB) medium är rikt på aminosyror från trypton och i vitaminer och tillväxtfaktorer från jästextrakt. Den stöder tillväxten av auxotrofer som inte kan syntetisera aminosyror, vitaminer och andra tillväxtfaktorer som behövs för tillväxt på M-9-medium. Således kommer prototrofer växa i LB och M-9-medium, medan auxotrofer kommer att växa i LB-medium, men inte i M-9-medium. Genom att introducera mutationer i ett prot population av bakterier och identifiera muterade gener som orsakar auxotrofa fenotyper är det possible för erhållande av en bättre förståelse av metabolismen i en bakteriestam.
Transposon mutagenes kan användas för att identifiera många av de gener som krävs för tillväxt på glukos i M-9-medium. Transposoner infoga sig själva slumpvis i värdgenomet 2. Genom observation transposonmutanter transformanter på LB-agarplattor och replika plating dem till M-9-medium agarplattor, är det möjligt att screena för auxotrofer. Avbrutna gener identifieras genom gen räddning. Denna studie använder en kommersiellt tillgänglig Tn 5 härledda transposome som levereras som en lösning av en linjär transposon DNA-segment blandat med transposas protein. DNA-segmentet saknar en transposas-gen, men den innehåller en gen för kanamycinresistens, en R6K γ-replikationsursprung och två mosaikmotiv som är DNA-sekvenser för transposas som binder vid varje ände av segmentet 3,4. Eftersom transposas-protein tillsätts direkt till DNA, ensam DNA-segmentetdefinieras som den transposon, och DNA / transposas proteinkomplexet definieras som transposome. Den transposome transformeras genom elektroporation 5 in i ett kanamycin känslig värd (Figur 1A). Kolonier som växer på LB-agarplattor innehållande kanamycin (LB-kan) ha transposonmutanter skär (Figur 1B), och replika pläterade transformanter som misslyckas med att växa på M-9-medium agarplattor innehållande kanamycin (M-9-kan) är auxotrofer (Figire 1C). Genomiskt DNA från en mutant renas och partiellt med den 4-base skär restriktionsendonukleas, BFU CI (figur 1D). Det ligerade DNA: t transformeras in i en stam av Escherichia coli (E. coli) som innehåller pir-genen (figur 1E). Denna gen ger den nya plasmid som innehåller transposonen och flankerande värdkromosomregion att replikera i E. coli 6. Kanamycinresistensgenen fungerar som såelectable markör för den nya plasmiden. Slutligen sekvensera med användning av primrar som är komplementära till vardera änden av transposonen och Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analys 7,8 av den resulterande sekvensen används för att bestämma identiteten för de avbrutna gener.
Denna transposome mutagenes strategi ger tre fördelar 3. Först, eftersom transposas proteinet är bundet direkt till transposonen, insättning inte beror på uttryck av nämnda transposas-gen i värden. När transposonen inkorporerar själv in i värdgenomet, är transposas nedbrytes, vilket förhindrar ytterligare rörelse av transposonet. Däremot kan ytterligare rörelse inte hindras om värden besitter en endogen Tn 5 transpositional element. För det andra, gör införandet av transposome genom elektroporering det möjligt att använda den i en mängd olika värdar. Det eliminerar också behovet av att införa transposonen genom bakteriell konjugering eller viral infektion. Båda processerna kräver värd känslighet. För det tredje, inkludering av kanamycinresistensgenen och R6K γ replikationsursprung i transposome gör det lättare att identifiera den avbrutna genen. Transposon-avbruten regioner kan lagras och sekvenserades såsom plasmider, vilket eliminerar behovet av att använda den inversa polymeraskedjereaktion (PCR) teknik för genidentifiering.
Protokollet presenteras i denna video beskriver varje steg för transposonmutagenes av Enterobacter sp. YSU 9 med en transposome från dess införande i bakteriecellerna till identifieringen av den förmodade gen den avbröts. Förutom tidigare publicerade protokoll 3,4,10, detaljerade förfaranden för användning replica plating för att screena för auxotrofer presenteras. Denna mutagenesteknik kan användas för att undersöka andra fenotyper, såsom antibiotika och metall resistanser, i olika typer av bakterier, för identifying minimalt antal gener som krävs för tillväxt under definierade odlingsbetingelser i syntetisk biologi studier, eller för att lära ett laboratorium komponent i en genetik eller mikrobiell fysiologi kursen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transposonmutagenes använder ett transposome är ett effektivt verktyg för att skapa auxotrofer i Enterobacter sp. YSU och andra typer av Gram-negativa och Gram-positiva bakterier 3,4. Processen initierades genom att införa Tn 5 härledda transposome i värden genom elektroporering. För att identifiera kolonier med inlägg, den otransformerade målet stammen måste vara känsliga för kanamycin för att selektera för resistens markör bärs av transposon. Vissa värdar producera restrik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författaren vill tacka alla mina grundutbildning Oberoende forskning Studenter och alla mina Microbial Physiology doktorander som testade mina transposonmutagenes idéer under 2010-2014 vårterminen. Detta arbete har finansierats av Institutionen för Biological Sciences vid Youngstown State University.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS – Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
- Kim, B. H., Gadd, G. M. . Bacterial physiology and metabolism. , (2008).
- Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
- Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).
- Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
- Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
- Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
- Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
- Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
- Ausubel, F., Brent, R., et al. . Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).
- Miller, J. H. . A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).
- Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
- Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
- Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
- Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
- Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
- Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).
