막 단백질의 실시간 측정 : 수용체 상호 작용은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)
Summary
표면 플라스 몬 공명 (SPR)은 실시간으로 생체 분자 상호 작용을 검출하기위한 라벨없는 방법이다. 여기서, 막 단백질을위한 프로토콜 : 기술의 장단점을 논의하는 동안 수용체 상호 작용 실험은 설명한다.
Abstract
Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed ‘ligand’) is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the ‘analyte’) is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method’s high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter’s cognate substrate binding protein).
Introduction
단백질 – 단백질 상호 작용 (PPI); 형성과 단백질 복합체의 해리는 많은 생물학적 과정 (예를 들어, 복제, 전사, 번역, 신호 전달, 세포 – 세포 통신)의 주요 이벤트입니다. PPI의 반 정량적 연구는 종종 풀다운 또는 면역 침전 실험을 사용하여 수행됩니다. 그러나 이러한 (유사한) 기술로 인해 이러한 기술에 내재 된 세척 단계로 측정 할 수있다 친화의 범위 (낮은 마이크로 몰과 높은 친 화성을) 제한됩니다. 이러한 "엔드 포인트"기술은 종종 큰 생물학적 결과의 일시적인 또는 선호도가 낮은 상호 작용을 식별 할 수 없습니다. 또한, 이러한 접근 방식의 시간 해상도는 극도의 반응 속도보다 느리다 보통 수주 제한된다. SPR은 인해 높아진 감도와 뛰어난 시간 해상도 1, 2에 이러한 단점을 극복한다. SPR과 같은, 라벨없는 방법(질량 변화를 검출 할 수있는 것이면), 분자 상호 작용은 측정 할 수있다. PPI 이외에, 그것은 광범위 단백질 – 리간드, 단백질 약물 (또는 작은 분자), 단백질 DNA, RNA 및 단백질 상호 작용 3-5을 특성화하는데 사용되어왔다. 결과 기록 및 실험 조건과 유연한 실험 설계의 신속한 수정을 가능하게 실시간에 그려집니다.
SPR 기반 악기 뒤에 물리적 원리는 질량이 변화에 따라 센서면에서의 굴절률의 변화를 측정하는 광학 시스템의 이용이다. 상호 작용 파트너 (이하 리간드) 중 하나는 폴리머 매트릭스 칩과 상기 제 분자 (이하, 피검) 표면 상에 고정화 흐르게된다. 분석 물에 결합하는 리간드 칩 표면에 질량을 변화. 이러한 질량의 변화는 직접적으로 비례 표면의 굴절률의 변화에 관한 것이다. 그 결과를 실시간으로 플롯 및시간의 함수로서 반응 단위 (RU)로 표시. 이러한 플롯은 sensogram이라고한다 (예를 들어, 그림 1). SPR은 상호 작용의 전체 시간 코스를 따르기 때문에, 미리 평형 운동 속도 상수는 평형 친화도에 부가하여, 유도된다. 아래에 설명 된 바와 같이, 주어진 시스템의 사전 평형 동작은 많은 정보를 보유하고, 혼자 평형보다 매우 다른 관점을 제공한다. 시스템이 교정되면, 실험은 매우 빠르며 (나노 그램 양하는 마이크로 그램) 단백질 물질의 소량을 필요로한다. 주어진 시스템의 전체 운동 정보를 수집하는 일 달성 될 수있다. SPR의 높은 민감도는 다른 기술 6을 사용 불가능 측정을 제공한다. 그러나이 감도는 위양성 데이터의 주요 원인이 될 수 있기 때문에 '양날의 칼'이다. 반사 지수에 영향을 미치는 요인은 기록 sensogram에 그려집니다. 같은 AP로방법은 적절한 제어는 가양를 제거하는 데 사용되어야하며, 상호 보완적인 접근 방식의 지원은 매우 좋습니다.
도 1은 NTA 코팅 센서 칩을 이용하여 SPR 실험의 진행을 도시한다. 패널에 sensogram는 NTA 매트릭스 위에 니켈 이온 (unsubtracted 데이터)의 주입을 도시하고, 패널은 BD 음성 대조군 세포로부터 유도 된 신호를 감산 한 후 데이터를 표시. 빨간색과 파란색 화살표는 각각 주입 시작과 끝을 보여준다. 분사가 종료 될 때까지의 칩 상에 리간드를 고정화 서서히 질량을 변경한다. 리간드의 분사 종료 후 관찰 안정 고원 표면 (그림 1B, 사이클 2)에 대한 리간드의 안정적인 관계를 반영한다. 안정한 기준선이 달성되면 버퍼 리간드 마도 주입 '빈 제어 "로서 기능 레퍼런스 셀 (사이클 3도 1b)을 통해 주입되고,되고분석에서 차감. 주입하면, 작은 변화는 칩을 통해 대량의 흐름을 반영, 기록됩니다. 그러면 별도의주기 (도 1b, 4 사이클)에서, 분석 물을 주입하고; RU의 점진적 증가는 리간드 분석의 관계를 나타냅니다. 평형에 도달 할 때까지 결합 부위가 점차 점유해진다. 즉시 분사가 종료로, RU에의 감소는 복잡한의 분리를 반영합니다. 미리 평형 평형 속도 상수가 도출 될 수 sensograms부터. (후에 참조) (1) 분석 물과 리간드 사이의 일시적인 상호 작용을 도시도. 상호 작용이 더 안정되면, RU 수준의 감소는 더 낮은 K D를 반영 느리다.
여기서 우리는, 동종의 기판 -6,7- 단백질 결합 막 수송 체 (세제가 용해) 및 그 기능 파트너 간의 상호 작용을 특성화 목표 SPR 실험을 설명한다. 선택 모드엘 시스템은 ATP 바인딩 카세트 (ABC) 수송, Archeaglobus 오글로 부스 풀기 두스의 ModBC-A이다. 이 시스템은 요금 '온 / 오프', 그 재현성이 높은 결과 잡음비 높은 신호를 선택하고, 고전 하였다. 또한, 동체 ABC 트랜스 포터는 중요한 부정적인 컨트롤을 제공 할 수 있습니다. 수송 체는, ModBC (리간드)을 세제, 정제 상에 고정화 칩을 이용하여 막으로부터 추출 하였다. 그 용해 작용 파트너 모다는 피 분석이다. 음성 대조군 리간드, 다른 ABC 트랜스 포터는 RbsBC ( "리간드 B")를 사용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SPR은 분자 상호 작용을 연구하는 고감도 방법이며, 과도 (아직 중요) 상호 작용의 실시간 모니터링을 제공하는 유일한 방법은 많다. 예는 다른 방법 (풀 – 다운 분석법 리포좀 침강 분석법 6)에 의해 검출 될 수없는 본 명세서 과도 상호 작용한다. 다른 방법 (정량적 또는 정 성적 관계없이) 측정을 평형 제한되어 있지만 또한, SPR은 미리 평형 동역학을 측정 만 기술 중 하나이다.
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007–47——N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
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