Desde un 2DE-Gel Spot para Función de Proteínas: Lección aprendida de HS1 en la leucemia linfocítica crónica
Summary
Aquí se describe un protocolo que las parejas de dos técnicas de proteómica, es decir, de 2 dimensiones electroforesis (2DE) y espectrometría de masas (MS), para identificar expresados diferencialmente / proteínas modificadas después de la traducción entre dos o más grupos de muestras primarias. Este enfoque, junto con los experimentos funcionales, permite la identificación y caracterización de los marcadores de pronóstico / dianas terapéuticas.
Abstract
La identificación de moléculas implicadas en la iniciación y progresión tumoral es fundamental para la biología de la comprensión de la enfermedad y, como consecuencia, para el manejo clínico de los pacientes. En el presente trabajo vamos a describir un enfoque proteómico optimizado para la identificación de moléculas implicadas en la progresión de la leucemia linfocítica crónica (CLL). En detalle, lisados de células leucémicas se resuelven por 2 dimensiones electroforesis (2DE) y visualizados como "puntos" en los geles 2DE. Análisis comparativo de los mapas proteómicos permite la identificación de proteínas expresadas diferencialmente (en términos de abundancia y modificaciones post-traduccionales) que se recogió, aislado e identificado por espectrometría de masas (MS). La función biológica de los candidatos identificados puede ser probada por diferentes ensayos (es decir, la migración, la adhesión y la polimerización de actina F), que se ha optimizado para las células leucémicas primarias.
Introduction
La leucemia linfocítica crónica (CLL), la leucemia adulta más común en los países occidentales, se deriva de la acumulación de CD5 + linfocitos B neoplásicas monoclonales y es clínicamente muy heterogénea. Puede estar presente como una forma pre-leucémica, definida como la linfocitosis monoclonal de células B (MBL) 1,2,3. En otros casos, la enfermedad puede aparecer ya sea con un curso clínico indolente, que puede permanecer estable durante años antes de necesitar tratamiento, o como una enfermedad resistente a la quimioterapia progresiva con pronóstico sombrío a pesar del tratamiento. Por último, puede progresar en un linfoma de alto grado con frecuencia letal (Síndrome de Richter-RS) 2,3,4. Los pacientes se suelen clasificar en dos subgrupos principales: el bien y el mal pronóstico, con base en un conjunto de factores pronósticos que proporciona información complementaria sobre los predictores de evolución de la enfermedad y la supervivencia. La heterogeneidad clínica probablemente refleja la heterogeneidad biológica. Un número de factores genéticos, microambientales y ceSe ha demostrado que los factores llular concurrir a la patogénesis de la enfermedad, aunque no se han encontrado mecanismos unificadores 5. En detalle, varios estudios han demostrado que las diferencias en el curso clínico de la enfermedad se pueden explicar en parte por la presencia (o la ausencia) de algunos marcadores biológicos que tienen un valor pronóstico 6,7,8. Estos datos demostraron que una mejor comprensión de la biología de la enfermedad podría proporcionar pistas adicionales para el manejo clínico de la patología, por la identificación de ambos marcadores de pronóstico y dianas terapéuticas.
El objetivo del presente trabajo es mostrar cómo una combinación de diferentes técnicas de proteómica se puede utilizar para la identificación de las proteínas implicadas en la aparición y progresión CLL. Nuestro enfoque demuestra que es posible unir juntos proteómico básica y los datos clínicos 5.
En el presente flujo de trabajo, las células leucémicas primarias de pacientes seleccionados(Bien vs mal pronóstico) están aislados y lisados celulares se usan después para obtener mapas proteómicos. 2DE permite la caracterización del perfil proteómico de una población de células, incluidas las modificaciones post-traduccionales, dando así información indirecta sobre la actividad biológica de cada proteína. Lisados de células enteras se resuelven por un primer plazo dimensión basada en el punto isoeléctrico, seguida de una segunda dimensión ejecutarse en un gel de poliacrilamida que resuelve las proteínas en función de su peso molecular. Análisis comparativo de los mapas proteómicos permite la identificación de proteínas expresadas diferencialmente (tanto en términos de abundancia y modificaciones post-traduccionales) como manchas en el gel que se pueden cortar y se analizaron por espectrometría de masas. El papel de cada candidato puede ser entonces explotada por diferentes ensayos.
Este enfoque, restringido a CLL en el manuscrito actual, se puede ampliar fácilmente a otras enfermedades / muestras, proporcionando así información sobre el proteomic / diferencias biológicas entre dos grupos (es decir, patológicas vs normales, estimulados vs no estimulada, de tipo salvaje vs knockdown).
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de este manuscrito es describir un protocolo optimizado para la identificación de moléculas implicadas en la patogénesis de la CLL, incluso si este enfoque puede extenderse a otras enfermedades y / o en otros tipos de muestras 16-18. Mediante la comparación de los perfiles proteómicos de 2 subconjuntos de pacientes con LLC, bueno contra mal pronóstico 19, hemos demostrado que se diferencian en el estado de fosforilación de HS1, y que su activación afecta a la capa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a la Unidad de linfoides, Elisa diez Hacken, Lydia SCARFO, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, y Angela Cattaneo.
Este proyecto fue apoyado por: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigador Grant y Programa Especial Molecular Oncología Clínica – 5 por mille # 9965)
CS y BA diseñó el estudio, realizado los experimentos, analizados los datos y escribió el manuscrito. MTSB, UR, FBPR ayudó a escribir el manuscrito. PG y FCC diseñados muestras El estudio aportó los pacientes y datos clínicos.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
References
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