アン<em>体外</em筋求心性神経の焼成特性を研究するための>成体マウス筋肉神経の準備

Summary

筋肉感覚ニューロンは自己受容体シグナル伝達に関与し、また代謝状態やけが関連するイベントについて報告している。私たちは、ストレッチ活性化筋求心性神経の研究のためのin vitroでの筋肉の神経に備えて成体マウスについて説明します。

Abstract

筋肉感覚ニューロンは筋紡錘やゴルジ腱器官は固有感覚に不可欠な長さと力の変化をエンコード支配。追加の求心性線維は、代謝産物の蓄積、温度、および侵害刺激を含む筋肉の環境の他の特性を、監視する。全体的に、感覚ニューロンの異常な活性化は、運動障害または慢性疼痛症候群につながることができます。私たちは、成体マウスでのストレッチ誘発求心性応答のin vitro研究のため長指伸筋（EDL）筋肉と神経の単離を記載している。感覚活動は吸引電極で神経から記録され、個別の求心性は、スパイクソーティングソフトウェアを用いて解析することができる。 インビトロ製剤は、麻酔の潜在的な交絡または変更された筋肉の灌流のない感覚求心性神経上の十分に制御された研究を可能にします。ここでは、識別してストレッチする筋紡錘求心性神経の応答を試験するためのプロトコルを記述します。重要なことは、この製剤はまた、薬物のアプリケーションおよびマウスでの強力な遺伝的アプローチと疾患モデルの取り込み後の筋求心性神経、応答特性の他のサブタイプの研究をサポートしています。

Introduction

骨格筋は、筋肉環境に関する重要な情報を中枢神経系を提供する感覚ニューロンにより神経支配されています。筋紡錘は、高度extrafusal筋線維と平行に配置されている錘内筋線維から構成されるカプセル化された構造を特化されます。スピンドルは、Ia族によって支配され、筋肉の長さと錘内繊維のトーンの変化をエンコードII求心性神経支配が動的ガンマ運動ニューロン¹によって調節される。 Ib族求心性神経は、筋収縮の²中に筋線維とその腱の挿入の間に配置され、筋力の変化に敏感である、例えばれている。 Ia族、IbおよびIIの求心性は、適切なモータ制御に役立つ固有受容フィードバックを提供する。筋肉全体に配置筋求心性神経の追加の集団（群IIIおよびIV）代謝産物の蓄積、侵害刺激の存在、および筋肉の温度を通知するために役立つ<sup> 3。この筋肉感覚情報は、恒常性を維持する筋肉損傷を防止し、動きを調節するために重要である。筋肉求心性は、以前の経験⁴に基づいて発火パターンを変更することができます。侵害受容器の活性化は、バランスや動き⁶で問題につながる可能性の筋自己受容器からの慢性疼痛状態⁵と異常なシグナル伝達の誘導につながることができます。私たちは、（図示2-4月齢のC57BL / 6マウスからの応答である）両方の性別の成体マウスから筋肉感覚神経受容体終末の応答を研究するために体外に備えて孤立筋肉神経を使う。マウスは、哺乳類での研究のためのモデルの遺伝種である。この準備は、坐骨神経の深い腓骨枝と長指伸筋（EDL）筋、下腿の外側部で見つかった腓骨グループの速筋の筋肉の単離を必要とする。 EDLは、多くの場合、筋肉の収縮特性^7-9を研究するために使用され、TEを持ってい隔離し、安静時および合理的な収縮のデューティ·サイクル¹⁰で十分な拡散性の酸素供給を可能にするのに十分に小さいが容易であるndons。 （インスタンスヒラメと前脛骨用）このエリアの他の筋肉が同様の大きさのものであり、この準備は簡単にこれらの筋肉からの求心性神経から記録するように修正することができる。吸引電極は、筋肉感覚求心性発火を記録するために、神経の切断端上に配置される。個別のニューロンを識別し、スパイクソーティングソフトウェアを使用してスパイク形状に基づいて分析することができる。浴中または神経に刺激電極は、筋収縮を誘発するために使用することができる。筋肉の長さおよび力が制御され、市販のシステムを用いて測定することができる。同様のin vitro調製物は、ラットのEDL ^11、Ia族およびラットの第四虫様つま先筋¹²とtにおけるグループIIIおよびIV筋求心性神経のII紡錘求心性神経でのグループIIIおよびIV筋求心性神経を研究するためにげっ歯類で使用されてきた彼のマウス足底筋^13。

in vitroの系では、薬理学的ア ​​クセシビリティと温度およびpHなどの灌流液および生理化学的変数を直接制御の利点を有している。 in vitroでのアプローチは、麻酔や筋肉灌流状態の潜在的なin vivoでの交絡を排除します。筋肉神経準備が求心上の摂動の直接的な反応の研究を可能にするが、in vivoで¹⁴またはex ³の製剤のように犠牲にされている生体内で可能な主軸感度および他の集積反応のガンマ遠心性変調を研究する能力この準備には神経細胞体は存在しない。

この調製は、以前のランプの電池に対するマウス筋紡錘求心性神経の応答を特徴付けストレッチや振動を保持するために使用し、これをマウススピンドル求心性RESPONSことが決定されたエスは、ラット、ネコ、及びヒトのような他の種で報告されたものと同様であった。マウススピンドル求心性応答は、34℃、絶対発火率で速かったものの、24℃と34℃の浴温の両方で類似していることが判明し、求心性は^、15を変えるより速く長さに対応することがよりできたました。私たちは、この準備が筋紡錘求心性神経を特定し、研究するために使用する方法を下に説明します。さらに、この調製物は、容易に薬物または疾患状態または各種他の変数（ 例えば 、年齢、性別、遺伝子ノックアウト）に応答して、感覚求心性神経の特性を比較するために、他の筋肉の求心性亜型¹³の応答を研究するために修飾することができる。

Protocol

適切な国内および機関の倫理、動物実験を行う前に取得する必要があります。 EDL筋肉と神経の1の除去計量し、深く、5％イソフルランプラス1.5リットル/分の酸素流量や底面のイソフルオラン浸した綿でベルジャで気化器を使用して吸入イソフルオランで成体マウスを麻酔。 マウスが深く麻酔をかけているとつま先のピンチに応答しないことを確認してください。すぐに大規模な、鋭利にハサミやギロチンを使用して首を切る。 はさみを使用して、リブを介して腹側正中カットを作成し、内臓を取り除く。 首のエリアから肌をつかみ、足を過ぎて、それを引っ張って動物スキン。 腰の上に切断することによって脚を除去し、冷却した（4℃）で皿に肌の足を置く、carbogenated（95％O 2、5％CO 2）、低カルシウム、高マグネシウム、重炭酸緩衝生理食塩水contaimM単位寧：128のNaCl、1.9のKCl、1.2 KH 2 PO 4、26 NaHCO 3を、0.85のCaCl 2、6.5のMgSO 4、および10グルコース（7.4±0.05のpH）16。低カルシウムは、高マグネシウム溶液は、解剖時にシナプス伝達を阻害する。 皿に脚の背側を上に置き、足をピンと膝と足首の関節が90°の角度になるように注射針や虫ピンを使ってヒップ。足の両端にピンを配置し、前部と後部のそれぞれに1ピンが所定の位置に組織を保持するために太もも。 カストロ春のはさみを使用して、太ももに筋肉の最上層を持ち上げ、真下坐骨神経を露出させるために正中カットをする。坐骨神経はちょうどトップ筋層の下に位置しており、ちょうど膝関節の前に総腓骨と脛骨神経に分岐するまでの腰近くの出口から大腿骨の上に実行されます。 経口まで坐骨神経上記の筋肉を削除するint型は、時趾屈長母（FHL）筋への深い腓骨神経枝ダイブが見える。 ＃55鉗子を使用して、脛骨の内側にある腓腹筋とヒラメ筋、からそれを解放するために腓骨枝の周囲の結合組織を解剖。腓腹筋とヒラメ筋の腱を切って、慎重に神経の下から削除します。 横する関節から内側足首に三つの異なる腱バンドルを露出させ、脛骨の側面に表面的な筋肉を削除します。FHL、EDL、および前脛骨（TA）、TAの下に隠されたEDLに。 持ち上げてEDLからのTAを持ち上げ、足関節でのTA腱をカットし、それを除去するための膝の近くの筋肉を切った。 足首でFHL腱を切り、神経がFHLに入る領域に到達するためにそれを戻って持ち上げます。ちょうどその点未満にカットし、FHL筋の〜2/3を削除します。 POSなどの股関節に近い坐骨神経をカットsible、優しく深い腓骨ブランチを除くすべての神経枝を剥ぎ取る。 大春のはさみを使用して、両方の足首と膝関節でのEDLの腱をカット。 鋭いハサミを使用して、膝に脛骨骨を切断することにより、周囲の組織からEDL、残りのFHLと神経を除去し、太ももの途中。ただEDL、FHLの一部と神経が残るように、残りの脛骨を離れてカットします。 組織浴にEDL筋肉と神経の2。取り付け（図1A） 実験開始前に、組織風呂を準備します。常に一緒にお風呂を灌流酸素化（100％O 2）の合成の間質液（SIF）123のNaCl、3.5塩化カリウム（単位：mm）を含む、0.7 硫酸マグネシウム、1.7のNaH 2 PO 4、2.0のCaCl 2、9.5 NAC 6 H 11 O（グルコン酸ナトリウム）、5.5グルコース、7.5スクロース、および10 N-2-hydroxyethylpiperazine- N '-2·エhanesulfonic酸（HEPES）; pHが7.4±0.05 17。 15〜30ミリリットル/分の流量を推奨します。力と長コントローラ（概算風呂寸法8.5センチメートル×3センチ×1センチメートルための槽の底、マウントされた組織ポストとマウントに固定された2つの刺激電極との25ミリリットルの容量の市販の入浴も示されている。仕様）材料/機器の表を参照してください。 孤立筋肉神経を処理し、組織浴にそれを配置するために、残りのFHL組織を使用してください。皿の底にSYLGARDの小片を置き、筋肉を安定させるために、残りのFHL組織を通して虫ピンを使用します。 （仕様のための材料/機器の表を参照のこと）力と長制御部のレバーアームの両方に腱を結ぶ組織ポストに一端を固定し、他のために6-0絹縫合糸を使用してください。実用的で最小の縫合糸の長さを使用してください。あなたは腱を縛られた後虫ピンとSYLGARDを削除します。注：簡単に促進するために、レバーへの接続は、ワイヤの小片は、エポキシでレバーアームに「J」字形フックに曲げて固定することができるアーム。縫合糸は、ワイヤに接続された代わりに、レバーアームの小さな穴に通すことができる。 第一のガラスマイクロピペットプラー（ヒート= 286、プル= 0、速度= 150、時間= 200）を使用して、SA 16ガラス吸引電極を作る; 3ミリメートルテーパー程度があるまで研ぎ石でそれを挽くバックし、手動で先端を破る。 （製品の詳細は、電極回路図について図1B-1C参照マテリアル/機器の表）1からサ ​​ンプルを希望する神経の面積に応じて以下10から100の間の所望の先端内径にマイクロフォージを使用して先端部を溶融。 SIF内側銀線にあらかじめ作られたガラス吸引電極を埋める。 電極中に神経の切断端を吸引し、差動増幅器の正のポートに接続します。塩素化銀電極を包みヘッドステージの負のポートに接続するワイヤ。グラウンドヘッドステージの接地ポートにバスからの第塩素化銀線を実行することにより、SIF風呂。また、灌流ポンプを介して導入された電気的ノイズを軽減するために、複数の点でのファラデーケージに灌流チューブを接地してください。 単収縮を誘発する組織浴中の筋肉のいずれかの側に取り付けられた電極を介して筋肉を刺激する。あるいは、神経の切断端に刺激電極を配置します。ピーク収縮力が観察されるまで刺激電圧を増加させ、その後、最大上電圧（0.5ミリ秒パルス幅）に到達するために追加の15％の電圧を増加させる。中間の10秒の残りの部分と、最大上電圧で筋収縮を続けますが、ピーク収縮力が筋肉の最適な長さ（L o を ）見つけることが達成されるまで、筋肉の長さを変える。すべての長さのスロープや振動はこのLENGで筋肉始まります目。 筋神経調製物は組織浴温度に到達するために、正常なシナプス伝達のための低カルシウム溶液中で解離下記回復できるように、その後のデータ収集の前に少なくとも1時間、浴中に留まることを可能にする。 室温以外の温度でデータを収集するには、筋肉に近い組織浴に温度プローブを配置します。ゆっくり組織浴ベースプレートを介して加熱された水をポンプで温度に風呂を上に持って来る。定常温度を維持するのを助けるために、SIF貯水池の周りに粘土電子レンジ加熱用のパッドを包みます。 3。データ収集スピンドル求心としての求心性を識別するために、秒ごと配信0.5ミリ最大上電圧刺激により生成繰り返さ筋収縮時の神経活動を記録します。注：筋紡錘求心性は、攣縮18,19（ 図2）中に一時停止する必要があります。 ダを使用してくださいtaの取得ソフトウェアは、異なる速度で異なる長さに、長さ変更を適用します。 （与えられたストレッチをカスタマイズする方法上のスクリプトや方向のスクリーンショットのための補足情報を参照）、この作業を自動化するカスタムスクリプトを使用してください。 2.5％、5％、7.5％L o のストレッチの長さおよび/ ​​秒15 20、40、または60％のL o の延伸速度で4秒のランプ·アンド·ホールド·ストレッチを適用する。注：必要な電圧 – ミリメートル換算係数の具体的な力と長コントローラのマニュアルを参照してください。 実験の最後に、最大の等尺性強縮性収縮（500ミリ列車、120 Hzの列車の周​​波数、0.5ミリ秒パルス幅、最大上電圧）を用いて24℃で筋肉の状態を判断する。以前に報告された値にピーク収縮力の比較（〜24 N / cm 2の9,20）。

Representative Results

筋求心性神経の応答が研究されている求心性サブタイプに応じて、摂動の多様以下を記録することができる。筋収縮とランプやストレッチを保持するために筋紡錘求心性神経の代表的な応答がここに示されています。スピンドル求心としての求心性を識別するために、単収縮収縮は収縮18,19の間に発射の一時停止があるかどうかを確認するために一度毎秒（0.5ミリ秒パルス幅）が与えられる。 図2に、中に代表的神経活動のトレースと筋肉の緊張を示していますこれらの筋収縮。スピンドル求心性のために予想されるように無神経活動は、筋収縮時に観察されない。記録された求心性はIb族ゴルジ腱器官の求心性だった場合、収縮中に発火率の増加が予想されるであろう。 34℃での規則的な発火パターン（24℃、〜12インパルス/秒〜32インパルス/秒を備えた制御条件の下で、ほとんどの求心）筋紡錘求心です。スピンドル求心性のサブセットは、ストレッチ中のみの火災（スピンドル求心性神経の私たちの手の中に〜11％）15。 図3Aは、ランプへの対応2筋紡錘求心性神経の代表生の痕跡を示しており、力と長コントローラによって生成されるストレッチを開催します。 LabChartののスパイクヒストグラム機能は個別に（ 図3B-3C）二つの個別のニューロンの瞬時発火頻度を特定し、分析するために使用される。 図1の単離された筋肉の調製A）長指伸筋（EDL）および神経支配坐骨神経を含酸素合成の間質液（SIF）で灌流単離された組織浴中に取り付けられている。 suctiに接続され、細胞外アンプ電極上に神経活動を記録します。適切なソフトウェア·コントロールと対策筋力と長コントローラを備えたデュアル力と長さ。組織浴電極は、けいれんや強直収縮を生成するために刺激を提供します。 。Cは、マイクロフォージを使用して生成された吸引電極のための理想的な先端形状の描写に拡大））のB。内槽プレートチャネルを通じて加熱された水を〜3ミリメートルで先細り先端をガラス吸引電極を引っ張った組織浴温度を制御するポンプ。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。 収縮を痙攣させる図2スピンドル求心性応答。神経たアクティビティY（上のトレース）および30筋の収縮からの筋肉の緊張（下のトレース）は、黒のトップ重なり合うトレースが重畳されている。求心性活動は、筋紡錘求心性神経の応答特性である収縮誘発性の張力増加、中に一時停止します。上のトレース上のブラケットと矢印は活動を一時停止している収縮の間の時間を示している。 図3スピンドル求心性応答は、ランプやストレッチAホールド）2求心性（上のトレース）の生の神経活動をランプ中およびEDL（下のトレースに示す筋長）。B）瞬時発火頻度（INSTに適用されるストレッチを保持する 。 A（青色で表示）からoを Lの活性を示す単位の神父、毎秒インパルス）。C）Instantane唯一の火災ストレッチ中に（オレンジ色で表示）より小さな単位のOUは発火頻度。両ユニットは、筋紡錘求心1の特徴であるストレッチ中にスパイク頻度順応を示す。

Discussion

この記事の目的は、単離したマウスの筋肉の神経に備えて筋紡錘求心性神経から記録するための方法を説明することでした。私たちは、マウスのスピンドル求心性神経は、ラット、ネコとヒト¹⁵からのもののように伸ばすことも同様に応答することを見出し、他の研究室は、in vitroで 、筋肉と皮膚の両方で感覚ニューロンを研究するためのモデル生物としてマウスを使用していた（例えば^、3,13用） 。

筋肉感覚求心性は、24℃と34℃の両方で少なくとも6-8時間記録することができる。 EDLや神経を扱う最小限に抑えるために、可能な限り、組織を処理するためにFHLの残りの部分を使用しています。解剖後、組織浴温度にし、回復するための正常なシナプス伝達のために平衡化させるためにデータ収集を開始するために、少なくとも1時間待つ。以前は、筋肉の健康は最大の強縮コントラことを決定することによって、この調製に用いられる筋肉のサブセット上で検証した筋肉によって生成されたctile力は、実験¹⁵の最初と最後に他者によって報告されたものと同様である。

筋紡錘の求心性は、（ 図3）（図2）収縮をけいれんに応じて、焼成中に特徴的なポーズを探しているだけでなく、長さの変化に応じて、予想される瞬間的な周波数が増加することによって、この準備として、機能的に同定された。われわれの経験では、制御条件に火災最も求心性は、筋紡錘求心性はある。この調製物（約7ミリメートル最大）に保持神経の長さは、筋求心性亜型^13を識別するために求心性伝導速度の違いを利用するのに十分な長さではない。また、猫と人間とは異なり、動的な感度の指標は明らかにマウスではIa族およびII求心性を区別することができませんでした（さらなる議論のためにウィルキンソンらを参照してください^。15）。求心性神経の他のサブタイプ（ すなわち、グループIIIおよびIV） など 、カプサイシン、ATP、またはブラジキニンのような物質を添加浴pHの低下、虚血筋肉を露出することによって、例えば、この製剤中の追加の機能テストを用いて同定することができる^3,13,21-23吸引電極を使用すると、単一の筋から採取することができるデータ量を増加させる、複数の感覚ニューロンからの活動を一度に記録することができる。この調製物は、感覚ニューロン群の応答または識別された求心性神経の応答に対する摂動の全体的な効果を評価するために使用することができる。スパイク形状が十分に一意である場合、最大4感覚ニューロンは（Spike2（ケンブリッジ電子設計）とLabChartのプロ（のAD·インスツルメンツ）の両方が同様に行われている）ソフトウェアによって判別することができる。ニューロンが判別できない場合において、電極配置や先端径の変化を容易に実現することができる。

体外 prepar における要約すると、マウスの筋肉神経ationは、さまざまな物理化学的摂動、傷害および疾病モデルに筋肉感覚求心性神経の応答特性を調べるために使用することができる簡単な実験的アプローチである。さらに、この製剤は、理想的にトランスジェニック動物および光遺伝学的ツールを含むマウスで利用できる強力な遺伝子ツール、を活用するために適しています。

Materials

Force and Length Controller & Tissue Bath	Aurora Scientific, Inc.	300C-LR & 809B-IV
Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head	Cole Parmer	EW-07523-80 & EW-77200-60
2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier	A-M Systems	Model 1800; 700000 & 700500
Simulator	Grass OR Aurora Scientific, Inc.	S88 OR 701 C
Dissecting Microscope	Swift	892070
Fiber Optic Light Source	Fiberlite	Model 190
Analog to Digital Board	AD Instruments	PL3508/P (PowerLab 8/35)
Data Acquisition & Analysis Software	AD Instruments	LabChart Pro 7
Electrode Holder	A-M Systems	672445
Electrode Glass	Dagan	SA16
Electrode Puller	Sutter Instrument Co.	P-80/PC
Microforge	Narishige	MF-9
Isoflourane	MWI Veterinary Supply	18627
Surgical Tools
Large Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14014-17
Large Forceps	Fine Science Tools	11000-12
Large Spring Scissors	Fine Science Tools	15006-09
#5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
#55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Sharp Scissors	Fine Science Tools	14059-11
6-0 Silk Suture	Fine Science Tools	18020-50
Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 ± 0.05)
Sodium Chloride	Sigma	S9888-1KG
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma	230391-500G
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506-500G
Sodium Gluconate	Sigma	S2054-500G
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S8282-500G
Glucose	Sigma	G5767-500G
Sucrose	Sigma	S5016-500G
HEPES	Sigma	H3375-250G
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	P0662-500G
Potassium Chloride	Sigma	P3911-500G
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014-500G