L'aspetto più studiato della biocompatibilità dei compositi dentali è la loro citotossicità 3D CLSM lasso di tempo di imaging combinato con fluorescente quantificazione del segnale consente di valutare sensibile del destino delle cellule nel corso del tempo. Utilizzando questo metodo potrebbe essere uno strumento efficace per valutare la citocompatibilità di compositi dentali.
E 'generalmente accettato che l'interazione in vitro materiale cella è un criterio utile nella valutazione di materiale dentale biocompatibilità. L'obiettivo di questo studio è stato quello di utilizzare 3D CLSM tempo di imaging lasso confocale per valutare la biocompatibilità in vitro di compositi dentali. Questo metodo fornisce un'indicazione precisa e sensibile della frequenza di cellule vitali in contatto con estratti compositi dentali. L'ELS in più basso ritiro, un composito dentale usato per restauro diretto, è stato preso come esempio. In vitro valutazione è stata effettuata su cellule di fibroblasti umani in coltura primarie gengivali utilizzando Live / colorazione Morto. Le immagini sono state ottenute con il sistema invertito confocale biologico FV10i e analizzati con il software 3.1 FV10-ASW. L'analisi delle immagini mostrava un leggero citotossicità in presenza del composto testato dopo 5 ore di time lapse. Una leggera diminuzione della vitalità cellulare è stato mostrato in contatto con il composito estratti Compar testatoed alle cellule di controllo. I risultati hanno evidenziato l'uso del 3D CLSM immagini time lapse come metodo sensibile per valutare qualitativamente e quantitativamente il comportamento biocompatibilità dei compositi dentali.
Uno dei principali standard indicati nelle raccomandazioni ISO per definire biocompatibilità è l'assenza di tossicità materiale per le cellule. Compositi dentali a base di resine possono rilasciare i componenti dalla matrice resinosa, che potrebbe essere inizialmente a causa di polimerizzazione parziale, e / o in seguito a causa di processi di degradazione nel tempo 1-4. Questi componenti rilasciati venire a contatto con i tessuti orali e possono avere vari inconvenienti, come orticaria e reazioni della mucosa 5, lo sviluppo di reazioni allergiche e di ipersensibilità in pazienti 6, modifiche di fibroblasti gengivali morfologia e riduzione di collagene di tipo I di proteine 7, immunosoppressione o Immunostimolazione su mitogeno -driven proliferazione di purificate linfociti T e delle cellule della milza 8 e danni al DNA in fibroblasti gengivali umani primari, che sottolinea il loro potenziale genotossico 9. Molti parametri possono influenzare la tossicità composito dentale, come l'ombra del composite, la fotopolimerizzazione, la composizione chimica del monomero della resina, il riempimento e il grado di conversione 10- 13. Dal potenziale tossico in vitro dei materiali può prevedere in situazioni in vivo e potrebbe essere paragonato a situazioni cliniche da parte lo studio di alcuni endpoint rilevanti. La citotossicità di compositi dentali e dei loro componenti sono stati ampiamente valutati usando sistemi di colture cellulari 14- 16.
Questi sistemi in vitro sono stati sviluppati per valutare compositi dentali biocompatibilità in termini di: crescita cellulare e l'apoptosi delle cellule utilizzando THP-1monocytes come le cellule 17, citotossicità in fibroblasti gengivali umani 18, potenziale infiammatorio in HaCaT cheratinociti come le cellule 2, la funzionalità delle cellule odontoblast- come MDPC-23 cellule 19, la riduzione dei livelli di RNA totale, e aumento significativo di induzione di apoptosi in gengivale cheratinociti umani 20 eDanno al DNA in fibroblasti gengivali e polpa di cellule 21.
Diverse metodologie sono suggeriti per studiare la biocompatibilità dei materiali compositi dentali. Saggi colorimetrici, che coinvolgono coloranti specifici e misurazioni di assorbimento di luce, rimangono i più comunemente utilizzati, per la loro relativa semplicità e basso costo 22- 26. Analisi al microscopio per contrasto luce consuma spesso più tempo e comporta costi più elevati. Tuttavia, queste tecniche di microscopia presentano alcuni importanti vantaggi. L'osservazione della struttura cellulare fornisce informazioni estese sugli effetti tossici esperti, fornendo così dati più rilevanti e sensibili. In particolare, l'introduzione di microscopia confocale 27 ha permesso l'osservazione delle strutture biologiche con il miglioramento risoluzione assiale rispetto al livello di campo tradizionali microscopi a fluorescenza. Quindi, l'imaging confocale è diventato un potente strumento di indagine in diversi campi diricerche mediche e scientifiche. In contrasto con tecniche di microscopia elettronica a scansione microscopia confocale offre la possibilità di visualizzare componenti distinti di cellule per incorporazione di marcatori fluorescenti specifici. La maggior parte di questi traccianti specifici sono stabili in ambiente acquoso, sensibilmente misurabili, poco costoso e non tossico 28, permettendo il loro uso in clinica e ricerche di laboratorio. Inoltre, l'essiccamento del campione e la fissazione richiesto per convenzionale analisi al microscopio elettronico non è necessaria per tempo di imaging lapse confocale, rilevamento così dipendente dal tempo è possibile anche su campioni. Rispetto alle immagini bidimensionali, il principio confocale consente una visualizzazione esemplare sottosuolo e la struttura ricostruzione tridimensionale delle diverse immagini in profondità ottenuti; che provocano, più precise e più strutturali particolari 29, 30. Il presente studio video è un esempio dell'uso di tridimensionale Time-lapse Confocal Laser Scanning Microscopy (3D-CLSM) in combinazione con l'etichettatura Live / Dead fluorescenti e la quantificazione del segnale come un metodo innovativo. La tecnica presentata in questo documento ha il vantaggio di consentire la valutazione e time-lapse sensibili di imaging di cellule vive senza modificare la struttura cellulare della valutazione. Non ci sono fasi di preparazione sono necessari prima dell'analisi confocale. In precedenza, la stessa colorazione è stata utilizzata per valutare la vitalità delle colture nuclei spongiosa 31 ma senza confocale time-lapse seguente. Allo stesso modo la stessa procedura di time-lapse confocale è stato utilizzato per valutare l'attività eritromicina tempo-kill nei batteri dei fanghi attivi in base al loro tipo Gram 32 utilizzando uno specifico batteri vivi / morti colorazione. Questi metodi sono stati recentemente adattato e utilizzato per confrontare la tossicità dei compositi dentali a base di monomeri di metacrilato 11.
Comportamento del materiale biocompatibilità è il parametro più prerequisito per essere valutato prima uso medico. Norme internazionali riguardano dispositivi medici ISO 10993 33 e in particolare materiali dentali ISO 7405 34. L'assenza di effetti tossici alle cellule circostanti è la norma chiave nella valutazione biocompatibilità di tali materiali. Ecco perché i test di citotossicità ha tale importanza nella valutazione del materiale dentale biocompatibilità 35-37. L'ISO ha suggerito metodi di prova possono essere basati sull'attività metabolica o l'integrità della membrana. Endpoint selezionati devono seguire specifiche condizioni di Classifica effetti negativi indotti da un materiale di prova in modo da minimizzare il tempo e il costo dei test di valutazione. L'attuale metodo di indagine (3D tempo confocale lapse) è l'integrità della membrana base. La valutazione di citotossicità tramite questo endpoint sembra essere un valido indicatore di biocompa cellularepatibilità con materiali testati ed è anche ISO approvato endpoint. In vitro test sono progettati per determinare come un campione di materiale riguarda un particolare tipo di cellula. Il saggio colorimetrico MTT è stato originariamente descritto da Mossman (1983) come un metodo utile per la misura della citotossicità in vitro e proliferazione cellulare. Il test MTT è basato sulla conversione del sale di tetrazolio in cristalli di formazano dalle cellule attive, che determina l'attività mitocondriale. Questo può essere tradotto dal tasso vitalità 38. Gupta e collaboratori hanno riportato che il test MTT è il metodo più utilizzato per misurare la citotossicità delle resine composite. Succinico deidrogenasi e le risposte di fosfatasi alcalina sono stati utilizzati anche per lo stesso scopo 39. Tuttavia, le cellule destino non possono essere seguiti, poiché il saggio MTT richiede uccidere le cellule in ogni punto di misura. Per monitorare più da vicino il comportamento delle cellule colorate in questo studio, diè stata effettuata l'osservazione rect di cellule vive, grazie al tempo di imaging lasso CLSM combinato con una breve colorazione protocollo, l'analisi automatica di immagini e la quantificazione del segnale fluorescente.
Compositi dentali entrano in stretto contatto con i tessuti orali, in particolare le cellule gengivali e pulpari. I fibroblasti potrebbero essere bersaglio di componenti rilasciati da questi compositi da restauro 40-41. Inoltre, diversi studi hanno riportato che le cellule immortali e le cellule primarie possono avere diverse risposte cellulari a contatto con biomateriali. Cellule primarie sono risultati essere più opportuno valutare biomateriali effetti 42. Questo spiega l'uso di cellule di fibroblasti gengivali umani primari come modello cellulare per valutare la citotossicità del composito dentale testati in questo studio. Il potenziale tossicità delle sostanze rilasciate dal composito dentale è stato ampiamente studiato 43-44. Per valutare tegli citotossica potenziale dei materiali, due celle modello di contatto potrebbe essere eseguita. Nel sistema modello diretto contatto il materiale viene posto direttamente con le cellule bersaglio mentre nel sistema contatti indiretti, le cellule bersaglio sono in contatto con eluisce da supporti biologica. Nelle applicazioni cliniche e per le procedure di restauro, composito dentale sono messi in contatto diretto con i tessuti gengivali. Per questo motivo, il protocollo sperimentale attuale è focalizzata sul sistema di contatto indiretto con fibroblasti gengivali umani (cellule in presenza di estratti composti testati). Come precedentemente riportato da Dahl e collaboratori, le risposte di citotossicità sono stati classificati come gravi (<30%), moderata (30-60%), leggero (60-90%) o non-citotossico (> 90%) in base alla relativa attività di valori ottenuti per i controlli 45. Pertanto, secondo questa classifica e alla luce dei risultati ottenuti (Tabella 1), composito ELS bassissima ritiro può essere classificato come very leggermente citotossici e ha mostrato un comportamento simile alle cellule di controllo durante l'intero periodo di lasso di tempo. Utilizzando il proprio stesso metodo di indagine, i risultati di questo studio potrebbero essere paragonate a quelle di uno studio recente pubblicato. L'ELS bassissima ritiro composito dimostrato biocompatibilità superiore rispetto ai due composti precedentemente testati utilizzati per la stessa applicazione clinica che è la restaurazione diretta 11. Ulteriori studi sono ancora necessari per stabilire più completo confronto.
Al momento di decidere che citotossicità test per l'approvazione di una valutazione specifica endpoint, è importante capire i vantaggi ei limiti di ogni test. Lo scopo principale della confocale è realizzare un'architettura 3-D di cellule e organi. La tecnica è in grado di rivelare non solo la superficie di un campione, ma anche la sua sottosuolo. Il protocollo qui descritto evidenzia l'uso del 3D CLSM tempo di imaging lapse confocale, come SensiMetodo tivo per valutare il comportamento di biocompatibilità in vitro di un composito dentale. Tuttavia, al fine di evitare le limitazioni incontrate in questo lavoro, workstation antivibranti potrebbero essere utilizzati al fine di consentire l'imaging più stabile e più lungo periodo; il piano del tavolo potrebbe isolare il sistema confocale utilizzato dagli effetti dannosi che le vibrazioni in laboratorio possono causare. Inoltre, i materiali da utilizzare nella cavità orale dovrebbe idealmente essere innocuo per i tessuti gengivali e non devono contenere sostanze che potrebbero causare tossicità sistemica. Conformemente alla metodologia utilizzata ed i risultati ottenuti dal presente studio si può concludere che il composto testato (ELS bassissima ritiro) non è citotossica nelle presenti condizioni sperimentali. Dato che il metodo CLSM può dare sensibilmente il tasso iniziale di cellule vitali, altre possibilità potrebbero prevedere per valutare più endpoint. In particolare, come è stato recentemente riportato che i monomeri compositi colpiscono le cellule thrOugh specie reattive dell'ossigeno (ROS) 46- 48, sono necessarie ulteriori indagini per valutare le correlazioni eventuale citotossicità tra le reti e la produzione di ROS segnalazione. Il protocollo futuro potrebbe essere progettato per valutare contemporaneamente la produzione di ROS (H 2 O 2 e / o O 2 – colorazione) e il rapporto di citotossicità (Live colorazione / morti) con tempo di imaging lasso CLSM.
The authors have nothing to disclose.
Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.
Olympus Fluoview FV10i | Olympus | Confocal microscope | |
O2/Co2 Incubator | Pnasonic | MCO 5M | Cell incubation |
Live/Dead® Kit | Invitrogen | MP 03224 | Stain |
ELS extra low shrinkage® | Saremco | Dental composite | |
DMEM medium | Sigma | D 6046 | Culture medium |
Trypsin | Sigma | T1426 | harvesting cells |
chamber slide system | PAA | 14220040X | Culture chamber |
penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | Cell culture |
Amphotericin B | PAA | P11-001 | Cell culture |
Foetal bovine serum | PAA | A11-101 | Cell culture |
Cell Counter | Merck Millipore | 00110230TP1 | Cell counting |