Секвенирование РНК анализ дифференциальных экспрессии генов в электропорации Чик эмбрионального спинного мозга
Summary
This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.
Abstract
In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.
Introduction
Генетические исследования на живых организмах часто используют куриный эмбрион в качестве модели, потому что в ово электропорации представляет собой быстрый и недорогой способ частично трансфекции эмбриональных структур в естественных условиях с ДНК строит 1-5. Бицистронный векторы экспрессии, которые кодируют один транскрипт, содержащий флуоресцентный репортер вместе с представляющим интерес геном, таким как pCIG 6 или 7 ПМЭС, позволяют быстро проверку качества трансфекции в требуемой области под стереомикроскопом до обработки эмбрионов для нисходящего анализа.
С учетом последних достижений в секвенирования ДНК, что теперь можно получить цифровые целые профили экспрессии транскриптом с использованием образцов РНК Секвенирование РНК 8,9. Таким образом, вместо того, чтобы трудоемких методов, которые позволяют анализ лишь несколько генных продуктов в параллель, например, в гибридизация, иммуногистохимии и количественной ПЦР, приготовление библиотек кДНК длявысокопроизводительного секвенирования может предоставить информацию о всей транскриптома. Наблюдение за экспериментальными эффектов на уровни экспрессии каждого отдельного гена может, в свою очередь обеспечивают мощные представление о путях изменены конструкции, используемой. Это особенно легко, если геномной сборка для организма, используемой доступен, таким образом, снова куриного эмбриона является подходящей моделью.
Если пользователь имеет доступ к надежным секвенирования генома центра, главный вопрос заключается в получении образцов РНК высокого качества. Эта работа показывает, к способу получения образцов РНК из трансфицированных нейронных труб, пригодных для Секвенирование РНК, а также на последующих стадиях для силикомарганца в анализе полученных данных. После электропорации в HH12-13 последующим 48 ч инкубации трансфецировали магистральные половинки спинного мозга рассекали в рибонуклеазных свободной условиях, немедленно лизируют и дальше не защищены от разрушения сверхнизким замораживания до очистки РНК и библиотеки подготовка трион.
Общественность сервер Galaxy 10 обеспечивает доступ к бесплатным ресурсам для анализа данных секвенирования высокой пропускной. Объем пространства предложены для зарегистрированных пользователей достаточно для небольших экспериментов, тем самым устраняя необходимость в локальной вычислительной инфраструктуры. Анализ данных Секвенирование РНК включает в себя фильтрацию, выравнивание и количественного / сравнение экспрессии генов. Хотя существуют общие принципы для анализа данных Секвенирование РНК, параметры фильтрации во многом будет зависеть от качества секвенирования и должна быть определена после анализа контроля качества исходных данных.
Этот протокол описывает шаги, чтобы получить и сравнить Секвенирование РНК профили из куриных эмбриональных спинного мозга трансфектированных в естественных условиях. Как представительный результат, сравнение наборов данных, полученных от двух независимых контрольных образцов, трансфицированных пустым вектором, показали, что метод является воспроизводимым и должен позволить идентифицировать дифференциально ExpresSED транскриптов в экспериментальных образцах. Таким образом, применение этого метода имеет потенциал, чтобы значительно увеличить число открытий после одного эксперимента и, таким образом, обеспечить большой набор данных для последующего расследования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предлагаем рекомендации для анализа эффектов после электропорации куриного спинного мозга. Хотя электропорации векторов ДНК чаще используется для гиперэкспрессией гена интереса, можно также использовать конструкции, кодирующие доминантные негативов, quimeric белки или прекур?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CYIY is supported by FAPESP (2012/14421-5) and FMV is supported by a fellowship from FAPESP (2009/53695-0). We thank the DNA Technologies Core at University of California, Davis for preparation and sequencing of the RNA-Seq libraries used in this work, the Galaxy team for providing an excellent and free interface for high-throughput sequencing data analysis tools and Dr. Marianne Bronner for allowing us to film in her laboratory space.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Indian ìnk | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| – 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| – 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| – 0.225 g CaCl2.2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| – 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| – 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| – ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| – ddH2O to 1 L | |||
| – Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| – 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| – 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| – 1.15 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| – 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| – ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| – ddH2O to 1 L and filter | |||
| – 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| – Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| – Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).
- Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).
- Ghadge, G. D., et al. Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord. Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).
- Megason, S. G., McMahon, A. P. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129 (9), 2087-2098 .
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).
- Cloonan, N., et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).
- Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice. BMC Biol. 6, 40 (2008).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. . Molecular cloning. A laboratory manual. , (1982).
- Wang, Y., et al. Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens. BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors. Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).
- Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).
