This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.
In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.
Estudos genéticos sobre os organismos vivos utilizam frequentemente o embrião de galinha como modelo porque em eletroporação in ovo representa uma forma rápida e barata para transf parcialmente estruturas embrionárias in vivo com DNA constrói 1-5. Vectores de expressão bicistrónicos que codificam um transcrito contendo um repórter fluorescente em conjunto com o gene de interesse, tais como PCIG 6 ou 7 PMES, permitir a verificação rápida da qualidade transfecção na região desejada sob um microscópio estereoscópico antes de processar os embriões para análise a jusante.
Com os recentes avanços na sequenciação de ADN, é agora possível obter perfis de expressão transcriptoma digitais inteiras a partir de amostras de ARN utilizando ARN-8,9 Seq. Portanto, em vez de métodos demorados que permitem a análise de apenas alguns produtos de genes em paralelo, tais como hibridação in situ, imuno-histoquímica e qPCR, preparação de bibliotecas de cDNA parade alto rendimento seqüenciamento pode fornecer informações de todo o transcriptoma. Observação dos efeitos experimentais sobre os níveis de cada gene único de expressão podem, por sua vez fornecem insights poderosos sobre os percursos alterados pela construção usado. Isto é particularmente fácil, se uma montagem genómico para o organismo utilizado, está disponível, assim, o embrião de galinha é novamente um modelo adequado.
Se o usuário tem acesso a um centro de sequenciamento do genoma de confiança, a questão principal é a obtenção de amostras de RNA de alta qualidade. Este trabalho demonstra um método para a obtenção de amostras de ARN a partir de tubos neurais transfectadas adequadas para a RNA-Seq, bem como os passos a jusante para a análise in silico dos conjuntos de dados resultantes. Após eletroporação em HH12-13 seguido de 48 horas de incubação, tronco transfectadas metades da medula espinhal foram dissecados em condições livres de ribonuclease, imediatamente lisadas e mais protegida da degradação por ultra-baixo de congelamento até purificação RNA e biblioteca preparatião.
O servidor público Galaxy 10 fornece acesso a recursos livres para análise de dados de sequenciamento de alto rendimento. A quantidade de espaço oferecido para usuários registrados é suficiente para pequenos experimentos, eliminando assim a necessidade de infra-estrutura computacional local. A análise de dados de RNA-Seq inclui filtragem, alinhamento e quantificação / Comparação da expressão do gene. Embora existam diretrizes gerais para a análise de dados de RNA-Seq, parâmetros de filtragem dependerá em grande parte a qualidade do sequenciamento e deve ser determinada após a análise dos dados brutos de controle de qualidade.
Este protocolo descreve os passos para obter e comparar os perfis de RNA-Seq de frango embrionário medulas espinhais transfectadas in vivo. Como um resultado representativo, a comparação de conjuntos de dados obtidos a partir de duas amostras de controlo independentes transfectadas com um vector vazio mostraram que o método é reprodutível e deve permitir a identificação de expres diferencialmentetranscrições sed em amostras experimentais. Portanto, a aplicação deste método tem o potencial para aumentar grandemente o número de descobertas após uma única experiência e, assim, proporcionar um grande conjunto de dados para investigação posterior.
Aqui nós fornecemos orientações para a análise dos efeitos após a eletroporação do frango medula espinhal. Embora eletroporação de vetores de DNA é mais freqüentemente usado para superexpressão de um gene de interesse, pode-se também usar construções que codificam negativos dominantes, proteínas quimeric ou precursores de siRNAs para gerar condições de função do gene knock-down 19-21. Na verdade, a comparação de perfis de transcriptoma resultantes de ambos gain- e análise por perda de f…
The authors have nothing to disclose.
CYIY is supported by FAPESP (2012/14421-5) and FMV is supported by a fellowship from FAPESP (2009/53695-0). We thank the DNA Technologies Core at University of California, Davis for preparation and sequencing of the RNA-Seq libraries used in this work, the Galaxy team for providing an excellent and free interface for high-throughput sequencing data analysis tools and Dr. Marianne Bronner for allowing us to film in her laboratory space.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Indian ìnk | Any supplier | ||
18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
3 ml syringe | BD | 309657 | |
Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
Ringer's solution (1 L) | |||
– 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
– 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
– 0.225 g CaCl2.2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
– 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
– 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
– ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
– ddH2O to 1 L | |||
– Filter and autoclave | |||
PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
– 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
– 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
– 1.15 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
– 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
– ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
– ddH2O to 1 L and filter | |||
– 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
– Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
– Autoclave | |||
Sieved spoon | Any supplier | ||
Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
Manual pipette pump | Any supplier | ||
Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
Microcentrifuge | Any supplier | ||
RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |