RNA-Seq Análise de Gene Expression Diferencial em electroporados Pintainho Embryonic Medular

Summary

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Abstract

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

Introduction

Estudos genéticos sobre os organismos vivos utilizam frequentemente o embrião de galinha como modelo porque em eletroporação in ovo representa uma forma rápida e barata para transf parcialmente estruturas embrionárias in vivo com DNA constrói ^1-5. Vectores de expressão bicistrónicos que codificam um transcrito contendo um repórter fluorescente em conjunto com o gene de interesse, tais como PCIG ⁶ ou ⁷ PMES, permitir a verificação rápida da qualidade transfecção na região desejada sob um microscópio estereoscópico antes de processar os embriões para análise a jusante.

Com os recentes avanços na sequenciação de ADN, é agora possível obter perfis de expressão transcriptoma digitais inteiras a partir de amostras de ARN utilizando ^ARN-8,9 Seq. Portanto, em vez de métodos demorados que permitem a análise de apenas alguns produtos de genes em paralelo, tais como hibridação in situ, imuno-histoquímica e qPCR, preparação de bibliotecas de cDNA parade alto rendimento seqüenciamento pode fornecer informações de todo o transcriptoma. Observação dos efeitos experimentais sobre os níveis de cada gene único de expressão podem, por sua vez fornecem insights poderosos sobre os percursos alterados pela construção usado. Isto é particularmente fácil, se uma montagem genómico para o organismo utilizado, está disponível, assim, o embrião de galinha é novamente um modelo adequado.

Se o usuário tem acesso a um centro de sequenciamento do genoma de confiança, a questão principal é a obtenção de amostras de RNA de alta qualidade. Este trabalho demonstra um método para a obtenção de amostras de ARN a partir de tubos neurais transfectadas adequadas para a RNA-Seq, bem como os passos a jusante para a análise in silico dos conjuntos de dados resultantes. Após eletroporação em HH12-13 seguido de 48 horas de incubação, tronco transfectadas metades da medula espinhal foram dissecados em condições livres de ribonuclease, imediatamente lisadas e mais protegida da degradação por ultra-baixo de congelamento até purificação RNA e biblioteca preparatião.

O servidor público Galaxy ¹⁰ fornece acesso a recursos livres para análise de dados de sequenciamento de alto rendimento. A quantidade de espaço oferecido para usuários registrados é suficiente para pequenos experimentos, eliminando assim a necessidade de infra-estrutura computacional local. A análise de dados de RNA-Seq inclui filtragem, alinhamento e quantificação / Comparação da expressão do gene. Embora existam diretrizes gerais para a análise de dados de RNA-Seq, parâmetros de filtragem dependerá em grande parte a qualidade do sequenciamento e deve ser determinada após a análise dos dados brutos de controle de qualidade.

Este protocolo descreve os passos para obter e comparar os perfis de RNA-Seq de frango embrionário medulas espinhais transfectadas in vivo. Como um resultado representativo, a comparação de conjuntos de dados obtidos a partir de duas amostras de controlo independentes transfectadas com um vector vazio mostraram que o método é reprodutível e deve permitir a identificação de expres diferencialmentetranscrições sed em amostras experimentais. Portanto, a aplicação deste método tem o potencial para aumentar grandemente o número de descobertas após uma única experiência e, assim, proporcionar um grande conjunto de dados para investigação posterior.

Protocol

1. electroporate do construto de interesse nos tubos neurais da HH12-13 frango embriões no ovo Usar um repórter fluorescente, de preferência, em uma transcrição bicistr�ica ou fundido com a proteína de interesse com um péptido intercalante 2a viral 11, para permitir uma rápida identificação de indivíduos com níveis satisfatórios de transfecção. NOTA: O tempo de incubação típico para esta fase é de cerca de 48 horas a 37,8 ° C. …

Representative Results

Para validar o método descrito, duas amostras de controlo foram gerados a partir de embriões electroporadas com as PMEs de vetores vazios 7 e uma amostra a partir de embriões transfectadas com o mesmo vector contendo a inserção construir SCRT2-ZnF, que codifica os domínios dedo-de-zinco de frango SCRT2 18. As amostras de RNA total produzindo 11-22 g cada foram obtidos a partir de misturas de 8 a 12 embriões. Todas as três amostras teve um valor óptimo RIN em 10 de um controlo de qualidade …

Discussion

Aqui nós fornecemos orientações para a análise dos efeitos após a eletroporação do frango medula espinhal. Embora eletroporação de vetores de DNA é mais freqüentemente usado para superexpressão de um gene de interesse, pode-se também usar construções que codificam negativos dominantes, proteínas quimeric ou precursores de siRNAs para gerar condições de função do gene knock-down ^19-21. Na verdade, a comparação de perfis de transcriptoma resultantes de ambos gain- e análise por perda de f…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Indian ìnk	Any supplier
18G x 1 1/2 needle	BD	305196
3 ml syringe	BD	309657
Tris	MP Biomedicals	819620
F D & C Blue 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	Food Dye used to visualize DNA injection
Ringer's solution (1 L)
– 7.2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
– 0.37 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
– 0.225 g CaCl2.2H2O	Fisher Scientific	10043-52-4
– 0.217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
– 0.02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
– ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4
– ddH2O to 1 L
– Filter and autoclave
PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)
– 8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
– 0.2 g KCl	Sigma-Aldrich	P-4504
– 1.15 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
– 0.2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
– ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2
– ddH2O to 1 L and filter
– 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)	Sigma-Aldrich	D-5758
– Shake vigorously and let stand overnight at room temperature
– Autoclave
Sieved spoon	Any supplier
Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes	Corning Life Sciences	351007
RNaseZap RNase decontamination solution	Life Technologies	AM9780
Fine point surgical scissors	Any supplier
Straight fine point tweezers	Any supplier
Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes	Kimble Chase	40A502
9'' glass Pasteur pipette	Any supplier
Manual pipette pump	Any supplier
Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes	Corning Life Sciences	MCT-150-C
Microcentrifuge	Any supplier
RNAlater solution for RNA stabilization	Life Technologies	AM7020
RNAqueous total RNA isolation kit	Life Technologies	AM1912
Molecular Biology Grade Ethanol	Any supplier
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA Sample Preparation Kit v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002