Organotypic hippocampal स्लाइस में बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग
Summary
Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.
Abstract
Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.
Introduction
ग्लूटामेट रिसेप्टर्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र synapses पर उत्तेजक synaptic प्रसारण के बहुमत मध्यस्थता. पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली की रीढ़ सिर पर स्थानीयकृत ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की दो प्रमुख उपप्रकार एन मिथाइल-D-aspartate (NMDA) और α-अमीनो-3-hydroxy-5 proprionic-4-methylisoxazole एसिड (AMPA) रिसेप्टर्स हैं. झिल्ली क्षमता आराम से कम, AMPA रिसेप्टर्स synaptic प्रसारण के दौरान पोस्टअन्तर्ग्रथनी वर्तमान के सबसे ले. हिप्पोकैम्पस में, NMDA रिसेप्टर पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली में AMPA रिसेप्टर्स की संख्या में परिवर्तन ट्रिगर करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है: एक "संयोग डिटेक्टर" के रूप में अभिनय द्वारा 1 अन्तर्ग्रथनी शक्ति 1 में परिवर्तन शुरू करने के लिए, NMDA रिसेप्टर synaptic तंत्र में भाग लेता है कि एक subcellular स्तर पर सीखने और स्मृति पिन लगा रहे हैं. Presynaptic ट्रांसमीटर रिलीज के साथ समानांतर में पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन की विध्रुवण के जवाब में, कैल्शियम NMDA के माध्यम से प्रवेश करती हैरिसेप्टर AMPA रिसेप्टर प्रविष्टि या हटाने 2 आरंभ करने के लिए. ये रिसेप्टर गतिशीलता अन्तर्ग्रथन plasticity आबाद: अन्तर्ग्रथनी शक्ति में कमी लंबे समय तक अवसाद 4 (लिमिटेड) है, जबकि अन्तर्ग्रथनी शक्ति में वृद्धि हुई है, लंबी अवधि potentiation 2,3 (एलटीपी) है. NMDA रिसेप्टर्स अपने प्रेरण नियंत्रित करने के लिए लगा रहे हैं, जबकि इसलिए AMPA रिसेप्टर आंदोलन, synaptic plasticity अभिव्यक्ति के लिए जिम्मेदार माना जाता है.
Synaptic प्रसारण और plasticity अंतर्निहित सटीक तंत्र का निर्धारण आदर्श synapses के छोटे आबादी, एकल synapses का अध्ययन की आवश्यकता है. कुछ synapses अत्यधिक होने के कारण synaptic कनेक्शन के छोटे और फैलाना प्रकृति के इस बेहद मुश्किल है सबसे synaptic आबादी के लिए इस स्तर, उदाहरण के लिए, 5 आयोजित की बाह्यदलपुंज, पर अध्ययन के लिए अनुकूल हैं जबकि. दो प्रमुख इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीक एकल synaptic कनेक्शन की जांच करने के लिए विकसित किया गया है: पहले न्यूनतम उत्तेजना है, wherएक प्रीसानेप्टिक फाइबर माना जाता है ई extracellularly को प्रेरित किया. दूसरी तकनीक synaptically जुड़े न्यूरॉन्स से दो एक साथ पूरे सेल रिकॉर्डिंग किया जाता है जहां रिकॉर्डिंग, बनती है. कम से कम उत्तेजना का एक बड़ा फायदा यह एक साथ एक पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन से रिकॉर्डिंग जबकि axonal पथ में एक बाह्य उत्तेजक इलेक्ट्रोड की नियुक्ति से जुड़े, प्रदर्शन करने के लिए तेजी से और अपेक्षाकृत सरल है. इस तकनीक का उपयोग करते समय प्राथमिक चिंता का विषय एक एकल कक्ष के विश्वसनीय उत्तेजना शायद ही कभी परीक्षण के बाद परीक्षण गारंटी दी जा सकती है.
पिछले पंद्रह वर्षों से हम नियमित तौर पर दो synaptically जुड़े पिरामिड न्यूरॉन्स 6-17 से पूरे सेल रिकॉर्डिंग बनती इस्तेमाल किया है. इस तकनीक का प्रमुख लाभ केवल एक प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन लगातार और मज़बूती से प्रेरित है. यह भी electrophysiological लक्षण वर्णन भी है लेकिन प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन 6,18 <के औषधीय हेरफेर न केवल अनुमति देता है/ Sup>. हालांकि, न्यूरॉन्स के बीच synaptic कनेक्टिविटी की संभावना 19 प्राप्त करने के लिए जुड़ा जोड़े मुश्किल बना, कम है. organotypic मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों का उपयोग synaptic संपर्क के रूप में इस बाधा विट्रो में फिर से स्थापित कर सकते हैं और इसके अलावा परिणामस्वरूप कनेक्टिविटी की प्रकृति देशी मस्तिष्क ऊतक 20 में समान है circumvents. इसके अलावा, organotypic संस्कृतियों को प्लास्टिसिटी तंत्र को सक्षम करने, एलटीपी, लिमिटेड 7-10,12-15,21 और बनती पल्स सुविधा (पीपीएफ) और अवसाद (पीपीडी) 6,22,23 सहित अल्पकालिक synaptic plasticity के अतिरिक्त रूपों व्यक्त न्यूरॉन्स के जोड़े में अध्ययन किया. यहाँ हम इस सफलतापूर्वक इन विट्रो प्रणाली में बनती रिकॉर्डिंग को प्राप्त करने में शामिल विस्तृत कार्यप्रणाली का वर्णन. यह जानकारी आसानी से तीव्र स्लाइस और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों सहित अन्य प्रयोगात्मक सिस्टम, के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम organotypic hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों में सफल बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग की स्थापना के लिए आवश्यकताओं का वर्णन किया है. बनती रिकॉर्डिंग भी तीव्र स्लाइस और अलग संस्कृति प्रणालियों 26,27 सहित कई तैयारियो…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.
Materials
| Organotypic cultures | Paired recordings | ||
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 filter paper | Faraday cage | ||
| #5 forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
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