التلاعب في الغدة الدمعية الفئران
Summary
الغدة الدمعية (LG) هي جهاز المتفرعة التي تنتج مكونات المائية للدموع اللازمة للحفاظ على صحة العين والرؤية. نحن هنا وصف الفئران LG تشريح والثقافة فيفو السابقين تقنيات فك مسارات الإشارات المشاركة في LG التنمية.
Abstract
الغدة الدمعية (LG) تفرز الدموع المائية اللازمة للحفاظ على بنية ووظيفة القرنية، وهي النسيج الشفاف الأساسية للرؤية. في الإنسان يقيم في LG واحدة في المدار فوق نهاية الجانبية من كل عين تقديم الدموع على سطح العين خلال 5 – 3 قنوات. الماوس لديه ثلاثة أزواج من الغدد العين الرئيسية، والأكثر درس منها الغدة الدمعية exorbital (LG) الواقعة الأمامي وبطني إلى الأذن. على غرار أجهزة غدي أخرى، فإن إل جي تطور من خلال عملية التشكل المتفرعة الظهارية التي برعم الظهارية واحد داخل اللحمة المتوسطة المختصرة يخضع جولات متعددة من برعم وتشكيل لاصق لتشكيل شبكة مترابطة معقدة من عنيبات إفرازية والقنوات. وقد تم توثيق هذه العملية معقدة بشكل جيد في العديد من أجهزة الظهارية أخرى مثل البنكرياس والغدة اللعابية. ومع ذلك، فقد كانت LG أقل تكتشف الكثير وآليات السيطرة على التشكل وضعيفة تحتوقفت. نعتقد أن هذا التمثيل الناقص كنظام النموذج هو نتيجة للصعوبات المرتبطة الحقائق، تشريح وزراعة وLG. وبالتالي، هنا وصفنا التقنيات لتشريح الجنينية الحصاد وبعدها LG وطرق فيفو السابقين الثقافة من الأنسجة.
Introduction
الغدة الدمعية (LG) هي المسؤولة عن إفراز المسيل للدموع المائي الحرج لحدة البصر والصحة، والصيانة، وحماية خلايا سطح العين. النتائج LG الخلل في واحدة من اضطرابات العين الشائعة والمنهكة: مرض العين الجافة تعاني من نقص مائي، التي تتميز تهيج العين، والحساسية الخفيفة، وانخفضت الرؤية 1. في الإنسان يقيم LG في المدار فوق نهاية الجانبية للعين حيث 5 – 3 مطرح الدموع القنوات ديعة على سطح العين. الماوس لديه ثلاثة أزواج من الغدد العين الرئيسية، والأكثر درس منها الغدة الدمعية (LG) الواقعة الأمامي وبطني إلى الأذن (exorbital) بالدموع السفر إلى العين عبر القناة المفرغة واحد. على غرار أجهزة غدي أخرى، فإن إل جي تطور من خلال عملية التشكل المتفرعة الظهارية التي برعم الظهارية واحد داخل اللحمة المتوسطة المختصرة يخضع جولات متعددة من برعم وتشكيل لاصق للم شبكة مترابطة معقدة من عنيبات إفرازية والقنوات (الشكل 1) 2. خلال تطوير يصبح ظهارة أوعية دموية، وكذلك بشدة معصب من قبل الأعصاب الحركية للعقدة الجناحية وإلى حد أقل من قبل الأعصاب متعاطفة من العقدة الرقبية العلوية 3. التفاعل بين كل هذه الخلايا، أي أنواع الخلايا العصبية، الظهارية، البطانية والوسيطة، ضرورية لوظيفة وصيانة الأنسجة الكبار. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية الكامنة تنسيق LG التنمية والتجدد وكذلك كيف يرشد نوع الاتصال بين الخلايا هذه العمليات لا تزال غير واضحة.
وقد سمح ظهور الجنينية الثقافة فيفو السابقين تقنيات تحديد مسارات النمو والتجدد في العديد من الأجهزة المتفرعة 4. زراعة فيفو السابقين يعطي للباحث القدرة على التعامل مع الجهاز (ليالميكانيكي أو وراثية أو كيميائية) في ظل ظروف محددة بالإضافة إلى تميز الجهاز وتطوير خلية خلية التفاعل في الوقت الحقيقي. إل جي exorbital من الفأرة هي قابلة للغاية لهذه التقنية وحددت الدراسات التي أجريت مؤخرا الأنظمة التي تنظم تطوره 2،5 الإشارة. ومع ذلك، على الرغم من الحاجة إلى فهم الاشارات الجزيئية التي تقوم عليها LG التطوير والتجديد، وأنه لا يزال حاليا دراسة سلوكه، على الأرجح بسبب الصعوبات التقنية في عزل الجهاز. في هذه الورقة، ونحن تصف كيفية عزل وتنفيذ فيفو السابقين الثقافة من الفئران الجنينية LG لتحديد البرامج التنموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
براعة للثقافة والتلاعب LG فيفو السابقين يوفر مزايا هامة لدراسة تطورها. وهذا يشمل السرعة التي يستطيع الباحث لاختبار الفرضيات والعديد من الاضطرابات التي يمكن القيام بها لتقييم مدى الظهارية، الخلايا العصبية، والخلايا البطانية mesencyhmal تتفاعل لتشكيل الجهاز. ومع ذلك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن نعترف التمويل المقدم من برنامج UCSF تخصيص الموارد.
Materials
| Name | Catalog #. | Company | Comments/Description |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1X PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10X | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1X | Prepared from 10X stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Ideal for harvesting glands from embryos | |||
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).
- Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development. Development. 127, 2563-2572 (2000).
- Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).
- Nigam, S. K. Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs. Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).
- Qu, X., et al. Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development. Development. 139, 2730-2739 (2012).
- Rebustini, I. T., et al. MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis. Developmental cell. 17, 482-493 (2009).
- Hoffman, M. P., et al. Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms. Development. 129, 24-5778 (2002).
- Steinberg, Z., et al. FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis. Development. 132, 1223-1234 (2005).
- Knox, S. M., et al. . Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).
- Magenheim, J., et al. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, 4743-4752 (2011).
- Jaskoll, T., et al. FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis. BMC developmental biology. 5, 11 (2005).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
