إعداد ثقافة بيليه الدم الجرثومي السريع لتحديد واختبار حساسية المضادات الحيوية
Summary
A السريع البكتيرية إعداد بيليه من ثقافة الدم إيجابية يمكن استخدامها كعينة لتطبيقات مثل التعرف بواسطة MALDI-TOF، غرام تلطيخ، اختبار الحساسية للمضادات الحيوية واختبار PCR القائم. النتائج التي يمكن أن ترسل بسرعة إلى الأطباء لتحسين نتائج المرضى الذين يعانون من التهابات مجرى الدم.
Abstract
التهابات مجرى الدم والإنتان هي أحد الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات. نتائج ناجحة للمرضى الذين يعانون من تجرثم الدم تعتمد على التحديد السريع للجراثيم لتوجيه العلاج بالمضادات الحيوية المثلى. تحليل بقع غرام من ثقافة الدم إيجابية يمكن أن تتم بسرعة وبالفعل تؤثر بشكل كبير على نظام المضادات الحيوية. ومع ذلك، ما زالت هناك حاجة إلى تحديد دقيق للجراثيم لتحديد العلاج الأمثل المستهدفة. نقدم هنا البكتيرية إعداد بيليه بسيطة وسريعة من ثقافة الدم الإيجابية التي يمكن استخدامها كعينة لعدة تطبيقات المصب الأساسية مثل تحديد الهوية من جانب MALDI-TOF MS، اختبار الحساسية للمضادات الحيوية (AST) من خلال القرص نشر الفحص الآلي أو أنظمة AST والتلقائية وفقا PCR-الاختبارات التشخيصية. أداء هذه الأنظمة تحديد وAST مختلفة تطبق مباشرة على كريات الدم البكتيرية الثقافة الاشتراكية جداmilar إلى الأداء التي تم الحصول عليها عادة من المستعمرات المعزولة نمت على لوحات أجار. بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، واقتناء السريع لبيليه البكتيرية ويقلل بشكل كبير من الوقت لتقرير كل من تحديد وAST. وهكذا، في أعقاب الثقافة الإيجابية الدم، وتحديد من قبل MALDI-TOF يمكن ذكرت في غضون اقل من 1 ساعة في حين أن نتائج AST AST الآلي من قبل أنظمة أو المقايسات نشر القرص ضمن 8 إلى 18 ساعة، على التوالي. وبالمثل، فإن نتائج الفحص السريع PCR القائم يمكن أن ترسل إلى الأطباء أقل من 2 ساعة في أعقاب تقرير لتجرثم الدم. معا، وتظهر هذه النتائج أن الإعداد السريع لبيليه البكتيرية ثقافة الدم لديه تأثير كبير على تحديد وقت وAST التحول وبالتالي على نتيجة ناجحة من المرضى الذين يعانون من التهابات مجرى الدم.
Introduction
التهابات مجرى الدم والإنتان في المرضى في المستشفيات هي أحد الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات. وهكذا، ويلاحظ الوفيات المتعلقة دموية العدوى في حوالي 14٪ إلى 37٪ من المرضى في المستشفى وربما تزيد إلى 35٪ في وحدات العناية المركزة المرضى 1-3. تحديد السريع للجراثيم هو محوري في توجيه العلاج المضادة للميكروبات الأمثل وزيادة نجاح العلاج المضادة للميكروبات 4،5. التحليل السريع للبقع غرام من ثقافة الدم إيجابية بالفعل لها تأثير كبير على تكييف العلاج المضادة للميكروبات 6،7 ولكن التحديد الدقيق للجراثيم هو مطلوب لتوفير أفضل العلاج بالمضادات الحيوية تتكيف مع المرضى. على سبيل المثال، تختلف نظم العلاج بالمضادات الحيوية لا بد من تنفيذها التالية تجرثم مع المكورات المعوية والعقديات التي يصعب تمييز من قبل غرام تلطيخ. وبالمثل، والتعرف على الأنواع ليفمطلوب ايل للكشف غرام enterobacteria السلبية ترميز الجينات الصبغية شركة المرفأ للطاقة التي تمنح مقاومة لزيادة β-اكتام 8.
مع ثقافة الدم إيجابية، ونهج التشخيص التقليدي لثقافة فرعية للجراثيم على لوحات أجار مختلفة، الأمر الذي يتطلب عدة ساعات من الحضانة إضافية تحديد مسبق مع الطرق المختلفة بما في ذلك الاختبارات البيوكيميائية والنمو على وسائل الإعلام المختلفة انتقائية ونظم التعرف الآلي الميكروبي. الوقت لنتائج نهج التشخيص التقليدي هو من حوالي 1 إلى 3 أيام.
وقد وفرت ظهور بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين وقت من الطيران مطياف الكتلة (MALDI-TOF) التكنولوجيا من أجل التعرف السريع على الكائنات الحية الدقيقة أداة جديدة لتحديد بسرعة الكائنات الدقيقة من المستعمرات نمت على لوحات أجار ولكن أيضا مباشرة من الدم إيجابي الثقافات (الشكل 1) 9-12. عشراستخدام البريد من MALDI-TOF لتحديد وكيل المعدية من الثقافات الدم قد قلل كثيرا من الوقت إلى النتائج لبضع دقائق بدلا من ساعات وأيام تتطلبها الطرق التقليدية. كما نوقش من قبل Croxatto وآخرون 13، وكفاءة تحديد MALDI-TOF تعتمد على معايير مختلفة بما في ذلك نقاء الكائن الدقيق وكميتها. يتم الحصول على هذين المعيارين بسهولة من مستعمرات منفصلة نمت على لوحات أجار ولكن تتطلب العلاج قبل تحليلية لتخصيب البكتيرية وتنقية من عينات معقدة مثل ثقافة الدم، والتي تحتوي على العديد من المكونات الخلوية والبروتينات التي قد تتداخل مع تحديد MALDI-TOF.
وقد استخدمت أساليب العزلة مختلف الكائنات الحية الدقيقة "من ثقافة الدم في عدد من الدراسات بما في ذلك سابونين أو غيرها من طريقة المنظفات معتدل لاستخراج بكتيريا 9،14، المصل طريقة فاصل 10، تحلل أساليب الطرد المركزي 12 </sتصل> والحلول تجاريا مثل مجموعة sepsityper. وقد وضعت لدينا مختبر التشخيص الجراثيم بسيطة ثقافة الدم بيليه البكتيرية إعداد استنادا كلوريد الأمونيوم كرات الدم الحمراء، التي تتيح تحديد هوية تحلل سريع من البكتيريا والخميرة بواسطة MALDI-TOF ونظم التعرف الآلي (الشكل 2) 15. هذا المستحضر بيليه ثقافة الدم كما توفر عينة لتطبيقات المصب المباشرة الأخرى مثل تلطيخ غرام، واختبارات التشخيص الآلي PCR القائم مثل POCT-تقارير إنجاز المشروعات للكشف السريع للمقاومة للميثيسيلين Staphyloccocus العنقودية الذهبية (الجرثومة)، واختبار الحساسية للمضادات الحيوية مع أنظمة AST الآلي و / أو عن طريق القرص المقايسات نشر على لوحات أجار (الشكل 3).
في هذا العمل، نحن تصف الخطوات المختلفة لإعداد بيليه البكتيرية ثقافة الدم كما أوضح Prod'hom وآخرون 15 (الشكل 4). ونحن أيضا إلغاءالكاتب البروتوكولات لثلاثة من التطبيقات الرئيسية التي يمكن القيام بها على بيليه ثقافة الدم: تحديد بواسطة MALDI-TOF 15، تحديد الهوية (ID) واختبار الحساسية للمضادات الحيوية (AST) مع النظم الآلية 16 لالمعوية والعنقوديات وPCR- الآلي اختبار تشخيصي استنادا للكشف عن الجرثومة 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقارنة مع النهج التشخيص التقليدية ثقافة الدم إيجابية، واقتناء السريع لبيليه البكتيرية باستخدام كلوريد الأمونيوم تحلل نهج الطرد المركزي يقلل من الوقت لتقرير الهوية من قبل 16 إلى 24 ساعة والوقت لتقرير AST قبل 24 إلى 48 ساعة (الشكلان 1 و 3).
<p class="jove_content" style=";text-align:r…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر فنيي مختبر علم الجراثيم في مركز مستشفى جامعة لوزان لمساعدتهم على تنفيذ التقنيات في المختبر.
Materials
| 20 needle gauge | Terumo, Leuven, Belgium | NN-2038R | |
| 50 ml Falcon tube | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 352070 | 50 ml centrifuge tubes |
| Ammonium chlorure | Merck, Darmstadt, Germany | 101145 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Fluka, St. Louis, MO, USA | 60340 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507 | Flammable, corrosive |
| a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Fluka, St. Louis, MO, USA | 70990 | Acute toxicity |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 271004 | Flammable, acute toxicity |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508 | Corrosive, acute toxicity |
| Vitek 2 60 instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27202 | automated microbial system instrument |
| Vitek 2 Gram-positive (GP) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21342 | automated GP identification card |
| Vitek 2 AST-P580 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 22233 | automated microbial AST system |
| Vitek 2 Gram-negative (GN) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21341 | automated GN identification card |
| Vitek 2 AST-N242 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 413391 | automated microbial AST system |
| Xpert MRSA | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXMRSA-100N-10 | nucleic acid amplification technology MRSA |
| GeneXpert IV instrument | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXIV-4-D | nucleic acid amplification technology instrument |
| Microflex LT MALDI-TOF MS instrument | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | BDAL microflex LT/SH | |
| MSP 96 target steel BC | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 280799 | MALDI target plate |
| Densitometer Densicheck instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27208 | |
| MALDI Sepsityper kit 50 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8270170 | |
| Mac Conkey agar | Biolife, Milano, Italy | 4016702 | |
| Mueller-Hinton agar | Oxoid, Hampshire, England | CM0337 | Mueller-Hinton agar (MH) |
| MHF agar | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 43901 | Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF) |
| BD columbia III agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254071 | blood agar |
| BD chocolate agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254089 | chocolate agar |
| BD schaedler agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254084 | Schaedler agar |
References
- Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
- Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
- Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
- Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
- Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
- Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
- Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
- Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
- Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
- Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
- Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
- Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
- Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
- Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. , (2013).
- Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
- Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
- Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).
