Utarbeidelse av en blodkultur Pellet for Rapid Bakteriell Identifisering og antibiotika resistenstesting

Summary

En rask bakteriell pellet preparat fra en positiv blodkultur kan anvendes som en prøve for applikasjoner som identifikasjon ved MALDI-TOF, Gram-farging, antibiotisk resistenstesting og PCR-basert test. Resultatene hurtig kan kommuniseres til klinikere for å forbedre resultatet av pasienter som lider av blodet infeksjoner.

Abstract

Blodet infeksjoner og sepsis er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet. Den vellykkede utfall av pasienter som lider av bakteriemi avhengig av en rask identifisering av infeksjonsmidlet for å lede optimal antibiotikabehandling. Analysen av Gram flekker fra positiv blodkultur kan være raskt gjennomført og allerede betydelig innvirkning på antibiotika regime. Imidlertid er den nøyaktige identifikasjon av smittestoffet fremdeles er nødvendig for å etablere den optimale målrettet behandling. Vi presenterer her en enkel og rask bakteriell pellet preparat fra en positiv blodkultur som kan bli brukt som en prøve for flere essensielle nedstrøms applikasjoner som identifikasjon ved MALDI-TOF MS, antibiotisk resistenstest (AST) av platen diffusjon assay eller automatiserte systemer AST og ved automatisert PCR-basert diagnostisk testing. Resultatene av disse ulike identifikasjons og ASAT systemer brukes direkte på blodkulturbakterie pellets er veldig siMilar til ytelsen normalt oppnådd fra isolerte kolonier dyrket på agarplater. Sammenlignet med konvensjonelle tilnærminger, reduserer den raske oppkjøp av en bakteriell pellet betydelig tid til å rapportere både identifisering og AST. Dermed kan følgende blodkultur positivitet, identifisering av MALDI-TOF bli rapportert i løpet av mindre enn en time, mens resultatene av AST fra automatiserte AST systemer eller plate diffusjon analyser innen 8 til 18 timer, henholdsvis. På samme måte kan resultatet av en hurtig PCR-basert assay bli kommunisert til klinikere mindre enn 2 timer etter rapport av en bakteriemi. Sammen utgjør disse resultatene viser at den raske utarbeidelse av en blodkultur bakteriell pellet har en betydelig innvirkning på identifisering og AST behandlingstid og dermed på det vellykkede resultatet av pasienter som lider av blodet infeksjoner.

Introduction

Blodet infeksjoner og sepsis i innlagte pasienter er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet. Dermed er dødelighet relatert til blodbanen infeksjoner observert hos ca 14% til 37% av innlagt pasient og kan øke til 35% i intensivavdelinger pasienter ^1-3. Den hurtige identifiseringen av infeksjonsmidlet er avgjørende for å lede optimal antimikrobiell behandling, og for å øke det vellykkede utfall av antimikrobiell terapi ^4,5. Den raske analyse av Gram flekker fra positiv blodkultur har allerede en betydelig innvirkning på tilpasning av antimikrobiell behandling ^6,7 men nøyaktig identifisering av smittestoffet er nødvendig for å gi best tilpasset antibiotikabehandling til pasientene. For eksempel ulike antibiotika behandlingsregimer må gjennomføres etter bakteriemi med enterokokker og streptokokker som er vanskelig å skille fra Gram farging. Tilsvarende identifikasjon på arten umel er nødvendig for å påvise Gram negative enterobakterier som koder for et kromosomalt gen som AmpC gi en øket motstand mot β-laktamer ^8.

Med en positiv blodkultur, er den konvensjonelle diagnostiske tilnærming til subkultur smittestoffet på forskjellige agar-plater, som krever flere timers ytterligere inkubering før identifikasjon med forskjellige tilnærminger inkludert biokjemiske tester, vekst på forskjellige selektive medier og automatiserte mikrobiell identifikasjonssystemer. Tiden til resultatene av en konvensjonell diagnostisk metode er av omtrent 1 til 3 dager.

Fremveksten av matrisen-assistert laser desorpsjon / ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF) teknologi for rask identifisering av mikroorganismer har gitt et nytt verktøy for å raskt identifisere mikroorganismer fra koloniene dyrket på agar plater men også direkte fra positivt blod kulturer (figur 1) ^9-12. The bruk av MALDI-TOF å identifisere en smittsom agent fra blodkulturer har redusert tid til resultatene til noen få minutter i stedet for timer og dager som kreves av tradisjonelle metoder. Som diskutert av Croxatto et al. ^13. effektiviteten av MALDI-TOF-identifikasjon er avhengig av forskjellige parametre inkludert mikroorganismen renhet og mengde. Disse to kriterier er lett oppnådd fra diskrete kolonier dyrket på agarplater, men kreves en forhånds analytisk behandling av bakteriell anrikning og rensing fra komplekse prøver som blodkultur, som inneholder flere cellulære og protein-komponenter som kan forstyrre MALDI-TOF identifikasjon.

Ulike mikroorganismer 'isolasjon metoder fra blodkultur har blitt brukt i en rekke studier inkludert saponin eller andre milde vaskemidler metode for bakteriell utvinning ^9,14, serum separator metode ^10, lyse sentrifugeringsmetoder ¹² </sopp> og kommersielt løsninger som sepsityper kit. Vår bakteriologi diagnostiske laboratorier har utviklet en enkel blod-kultur bakteriell pellet preparat basert på ammoniumklorid erytrocytt-lysering, som tillater hurtig identifisering av bakterier og gjær ved MALDI-TOF, og automatiske identifikasjonssystemer (figur 2) ^15. Dette blod-kultur pellet forberedelse også gi et eksempel for andre direkte nedstrøms applikasjoner som Gram farging, automatisert PCR-baserte diagnostiske tester som POCT-PCRs for rask påvisning av meticillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA), og antibiotika resistenstesting med AST automatiserte systemer og / eller ved å disk diffusjon Målinger på agarplater (figur 3).

I dette arbeidet, vil vi beskrive de forskjellige trinnene for fremstilling av blod-kultur bakteriell pellet som forklart av Prod'hom et al. ¹⁵ (figur 4). Vi vil også utelattskriver protokollene for tre av de viktigste programmene som kan utføres på blodkultur pellet: Identifikasjon av MALDI-TOF ^15, identifikasjon (ID) og antibiotika resistenstesting (AST) med automatiserte systemer ¹⁶ for Enterobacteriaceae og stafylokokker og automatisert PCR basert diagnostisk test for påvisning av MRSA ^17.

Protocol

Denne protokollen har blitt utviklet og validert følge forskning og utvikling prosesser og etiske regler for vår institusjon før de blir implementert som en rutinemessig verktøy. 1. Utarbeidelse av en blodkultur Bakteriell Pellet av salmiakk Erythrocyte-lyse Prosedyre Fremstilling av en positiv blodkultur for påfølgende sentrifugering. Sterilisere cap blodkultur. Legg 70% etanol på hetten på flasken og brenne det. MERK: Ikke gjør dette trinnet under en lam…

Representative Results

I undersøkelsen utført av Prod'hom et al. 15, ble bakterie pellets fremstilt ved ammoniumklorid lysis sentrifugering av 122 positive blodkultur fra 78 pasienter analyseres med MALDI-TOF MS. Ut fra 122 positive blodkultur, 95 (77,9%) ble korrekt identifisert på artsnivå og en (0,8%) ved slekten nivå. De resterende 26 (21,3%) av blodkultur pellets ga ingen sikker identifikasjon av MALDI-TOF. Blant dem, var 21 gram positive bakterier hvorav 13 streptokokker og 5 koagulase-negative stafylokokker…

Discussion

Sammenlignet med konvensjonelle positive blodkultur diagnostiske metoder, den raske anskaffelse av en bakteriell pellet ved hjelp av ammoniumklorid lysis sentrifuge tilnærming reduserer tiden for å rapportere identifisering av 16 til 24 timer, og tiden til å rapportere AST etter 24-48 timer (figurene 1 og 3).

Rapid innføring av egnede antibiotika er dreibar for å forbedre resultatet av pasienter som lider av blodet infeksjoner. Dermed tidlig identifisering av smittestof…

Materials

20 needle gauge	Terumo, Leuven, Belgium	NN-2038R
50 ml Falcon tube	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure	Merck, Darmstadt, Germany	101145
Potassium hydrogen carbonate	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507	Flammable, corrosive
a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	Acute toxicity
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	271004	Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27202	automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21342	automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	22233	automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21341	automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	413391	automated microbial AST system
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXMRSA-100N-10	nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXIV-4-D	nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target  steel BC	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	280799	MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27208
MALDI Sepsityper kit 50	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8270170
Mac Conkey agar	Biolife, Milano, Italy	4016702
Mueller-Hinton agar	Oxoid, Hampshire, England	CM0337	Mueller-Hinton agar (MH)
MHF agar	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	43901	Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254071	blood agar
BD chocolate agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254089	chocolate agar
BD schaedler agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254084	Schaedler agar