Preparação de uma Cultura Pellet sangue para rápida identificação bacteriana e Antibiótico Teste à Susceptibilidade

Summary

Uma preparação sedimento bacteriano rápida de uma cultura de sangue positiva pode ser utilizado como uma amostra para aplicações tais como a identificação por MALDI-TOF, a coloração de Gram, teste de susceptibilidade aos antibióticos e ensaios baseados em PCR. Os resultados podem ser rapidamente comunicados aos médicos para melhorar a evolução dos pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea.

Abstract

Infecções da corrente sanguínea e septicemia são uma das principais causas de morbidade e mortalidade. O êxito de pacientes que sofrem de bacteremia depende de uma rápida identificação do agente infeccioso para orientar o tratamento antibiótico ideal. A análise de manchas Gram de hemocultura positiva pode ser rapidamente realizada e já impactar significativamente o regime de antibióticos. No entanto, a identificação precisa do agente infeccioso ainda é necessário para estabelecer o melhor tratamento direcionado. Apresentamos aqui uma preparação pellet bacteriano simples e rápido de uma hemocultura positiva que pode ser usado como um exemplo para várias aplicações a jusante essenciais, como a identificação por MALDI-TOF MS, teste de sensibilidade aos antibióticos (AST) pelo método de difusão de disco ou sistemas automatizados AST e por PCR automatizados baseados em testes de diagnóstico. O desempenho desses sistemas de identificação e AST diferentes aplicados diretamente sobre as culturas de sangue pelotas bacterianas é muito siMilar para o desempenho, normalmente obtido a partir de colónias isoladas cultivadas em placas de agar. Em comparação com métodos convencionais, a rápida aquisição de um sedimento bacteriano, reduz significativamente o tempo de identificação e relatam tanto AST. Assim, seguindo a positividade da hemocultura, identificação por MALDI-TOF podem ser relatados em menos de 1 hora enquanto que os resultados de AST por sistemas automatizados ou AST difusão em disco dentro de 8 a 18 horas, respectivamente. Da mesma forma, os resultados de um ensaio baseado em PCR rápida podem ser comunicadas para os clínicos menos do que 2 horas após o relatório de uma bacteremia. Juntos, estes resultados demonstram que a preparação rápida de um sedimento de bactérias hemocultura tem um impacto significativo sobre o tempo de identificação e AST reviravolta e, portanto, sobre o sucesso de pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea.

Introduction

Infecções da corrente sanguínea e septicemia em pacientes hospitalizados são uma das principais causas de morbidade e mortalidade. Assim, a mortalidade relacionada com a corrente sanguínea infecções é observada em cerca de 14% a 37% dos pacientes hospitalizados e pode aumentar para 35% em unidades de terapia intensiva de pacientes ^1-3. A rápida identificação do agente infeccioso é fundamental para orientar o tratamento antimicrobiano ideal e aumentar o êxito da terapia antimicrobiana ^4,5. A análise rápida da coloração Gram da hemocultura positiva já tem um impacto significativo sobre a adaptação da terapia antimicrobiana ^6,7, mas a identificação precisa do agente infeccioso é obrigada a fornecer o tratamento antibiótico mais adequado às pacientes. Por exemplo, diferentes regimes de tratamento antibiótico devem ser implementadas após bacteremia com enterococos e estreptococos que são difíceis de distinguir pela coloração de Gram. Do mesmo modo, a identificação da espécie level é necessária para detectar bactérias Gram enterobactérias negativa que codifica um gene cromossómico ampC que conferem uma maior resistência à β-lactâmicos ^8.

Com uma hemocultura positiva, a abordagem convencional de diagnóstico é a subcultura do agente infeccioso em diferentes placas de ágar, que requer várias horas de incubação adicional identificação prévia com várias abordagens, incluindo testes bioquímicos, o crescimento em diferentes meios seletivos e sistemas de identificação microbiana automatizadas. O tempo para os resultados de um método de diagnóstico convencional é de cerca de 1 a 3 dias.

O surgimento da tecnologia de matriz assistida por laser de dessorção / ionização por espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF), para a rápida identificação de microrganismos forneceu uma nova ferramenta para identificar rapidamente os microrganismos a partir de colónias que cresceram em placas de agar como também directamente a partir de sangue positiva culturas (Figura 1), ^9-12. The uso de MALDI-TOF para identificar um agente infeccioso a partir de culturas de sangue tem reduzido significativamente o tempo para resultados de alguns minutos em vez de horas e dias exigidos por métodos tradicionais. Como discutido por Croxatto et al. ^13, a eficiência de identificação de MALDI-TOF depende de diferentes parâmetros, incluindo a quantidade e pureza do microrganismo. Estes dois critérios são facilmente obtidos a partir de colónias discretas cultivadas em placas de agar, mas é necessária uma pré-tratamento analítico de enriquecimento bacteriana e purificação de amostras complexas, tais como a cultura de sangue, que contêm vários componentes celulares e de proteínas que podem interferir com a identificação de MALDI-TOF.

Vários métodos de isolamento de microrganismos de cultura do sangue tenham sido utilizados num certo número de estudos, incluindo a saponina ou outro método de detergentes suaves para a extracção ^9,14 bacteriana, método de separação de soro de ^10, a lise métodos de centrifugação ¹² </sse> e soluções comercialmente, tais como o kit sepsityper. O nosso laboratório de diagnóstico bacteriológico desenvolveu um simples sangue-cultura preparação sedimento bacteriano à base de cloreto de amónio-lise dos eritrócitos, que permitem uma identificação rápida de bactérias e levedura por MALDI-TOF e sistemas de identificação automáticos (Figura 2) ^15. Esta preparação de pelotas de sangue-cultura também fornecer uma amostra para outras aplicações diretas jusante, tais como coloração de Gram, testes de diagnóstico automatizado com base na PCR, como POCT-PCRs para a detecção rápida de resistente à meticilina Staphylococcus aureus (MRSA), e os testes de sensibilidade aos antibióticos com sistemas automatizados de AST e / ou por ensaios de difusão de disco em placas de agar (Figura 3).

Neste trabalho, nós descrevemos os diferentes passos para a preparação do sedimento bacteriano sangue-cultura, tal como explicado por Prod'hom et al. ¹⁵ (Figura 4). Nós também irá deescriba os protocolos de três das principais aplicações que podem ser executadas no pellet hemocultura: Identificação por MALDI-TOF ^15, a identificação (ID) e teste de sensibilidade aos antibióticos (AST) com os sistemas automatizados ¹⁶ de Enterobacteriaceae e estafilococos e PCR-automatizado teste de diagnóstico baseado na detecção de MRSA ^17.

Protocol

Este protocolo foi desenvolvido e validado seguindo os processos de pesquisa e desenvolvimento e as normas éticas da nossa instituição antes de ser implementado como uma ferramenta de rotina. 1 Preparação de uma Cultura de sangue bacteriana Pellet por Amônio Procedimento Chloride Erythrocyte-lise Preparação de uma hemocultura positiva para posterior centrifugação. Esterilizar a tampa hemocultura. Adicionar 70% de etanol na tampa da garrafa e queimá-lo. N…

Representative Results

No estudo realizado por Prod'hom et al. 15, peletes bacterianas obtidas por lise de cloreto de amónio a centrifugação de 122 cultura sanguínea positiva a partir de 78 doentes foram analisadas por MALDI-TOF MS. Fora de 122 hemocultura positiva, 95 (77,9%) foram corretamente identificados ao nível da espécie e um (0,8%) no nível de gênero. Os restantes 26 (21,3%) pelotas de hemocultura não deu nenhuma identificação confiável por MALDI-TOF. Entre esses, 21 eram bactérias gram positivas,…

Discussion

Comparado aos métodos diagnósticos hemocultura positiva convencionais, a rápida aquisição de um sedimento de bactérias, utilizando o cloreto de amônio lise abordagem centrifugação reduzir o tempo para relatar a identificação por 16 a 24 horas eo tempo para relatar AST por 24-48 horas (Figuras 1 e 3).

A rápida introdução de antibioticoterapia adequada é fundamental para melhorar a evolução dos pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea. Assim,…

Materials

20 needle gauge	Terumo, Leuven, Belgium	NN-2038R
50 ml Falcon tube	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure	Merck, Darmstadt, Germany	101145
Potassium hydrogen carbonate	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507	Flammable, corrosive
a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	Acute toxicity
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	271004	Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27202	automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21342	automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	22233	automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21341	automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	413391	automated microbial AST system
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXMRSA-100N-10	nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXIV-4-D	nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target  steel BC	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	280799	MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27208
MALDI Sepsityper kit 50	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8270170
Mac Conkey agar	Biolife, Milano, Italy	4016702
Mueller-Hinton agar	Oxoid, Hampshire, England	CM0337	Mueller-Hinton agar (MH)
MHF agar	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	43901	Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254071	blood agar
BD chocolate agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254089	chocolate agar
BD schaedler agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254084	Schaedler agar