Isolatie en Cultuur van Gedissocieerde sensorische neuronen van Chick Embryo

Summary

Celkweekmodellen gedetailleerde controle milieuomstandigheden en dus een krachtig platform om verschillende aspecten van neuronale cel biologie. We beschrijven een snelle, goedkope en betrouwbare wijze te isoleren, dissociëren en cultuur sensorische neuronen van kippenembryo's. Details van de ondergrond voorbereiding en immuuncytochemie zijn ook aanwezig.

Abstract

Neuronen zijn veelzijdige cellen die informatie essentieel is voor een verscheidenheid aan functies, waaronder sensatie, motoriek, leren en geheugen uit te voeren. Studeren neuronen in vivo kan lastig zijn vanwege hun complexiteit, hun gevarieerde en dynamische omgevingen, en technische beperkingen. Daarom bestuderen neuronen in vitro gunstig kan blijken om de complexe geheimen van neuronen ontrafelen. De goed gedefinieerde aard van celcultuur modellen biedt gedetailleerde controle over de milieu-omstandigheden en variabelen. Hier beschrijven we hoe te isoleren, distantiëren, en cultuur primaire neuronen van kippenembryo's. Deze techniek is snel, goedkoop en genereert stevig groeiende sensorische neuronen. De procedure produceert vaste culturen die sterk verrijkt voor neuronen en heeft zeer weinig niet-neuronale cellen (minder dan 5%). Primaire neuronen niet goed aan onbehandelde glas of weefselkweek plastic derhalve gedetailleerde procedures twee Distin creërenct, goed gedefinieerde-laminin bevatten substrata voor neuronale plating worden beschreven. Gekweekte neuronen zijn zeer vatbaar voor meerdere cellulaire en moleculaire technieken, met inbegrip van co-immunoprecipitatie, live cell verbeelden, RNAi, en immunocytochemie. Procedures voor dubbel immunocytochemie volgende gekweekte neuronen werden geoptimaliseerd en beschreven.

Introduction

Neuronen zijn complexe cellen die informatie essentieel is voor een verscheidenheid aan functies, waaronder sensatie, visie, motoriek, leren en geheugen uit te voeren. Unieke van andere celtypen, neuronen verlengen arm-achtige processen axonen, essentiële neurale snelwegen communicatie vormen. Tijdens de ontwikkeling van gespecialiseerde compartimenten zich aan de uiteinden van de groeiende axonen, de zogenaamde groei kegels, navigeren door een concert van extracellulaire signalen naar de axon naar de juiste bestemming te leiden. De ingewikkelde moleculaire mechanismen die groeikegel navigatie grondslag liggen zijn niet volledig begrepen. Om beter te begrijpen van deze mechanismen, hebben de onderzoekers gebruikt celcultuur modellen voor neuronen in een gedefinieerde en vereenvoudigde in vitro-omgeving te bestuderen. Studeren neuronen in cultuur ¹ heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van de neuronale celbiologie waaronder: neuronale differentiatie ^2, cytoskelet dynamiek, endocytose en mensenhandel, dendrietregulatie ^3,4, axonale regeneratie ^5, en klinische aandoeningen zoals neuropathieën ^6. Bovendien gekweekte neuronen zeer vatbaar voor diverse onderzoekstechnieken zoals immunocytochemie, celoppervlak co-immunoprecipitatie, Western blot, transfectie, RNAi en levende imaging zoals timelapse analyse van groeikegel motiliteit. Aldus kweken van primaire neuronen is een krachtige aanpak talrijke aspecten van de celbiologie van neuronen helderen.

De celcultuur model biedt onderzoekers met gedetailleerde controle over de milieu-omstandigheden en variabelen. Bijvoorbeeld kan het substraat waarop neuronen uitgeplaat (en groeien op) gemakkelijk worden gemanipuleerd. Hier geven we gedetailleerde instructies voor het genereren van twee verschillende substraten, een met een lage concentratie laminine-1 en de andere met verzadigende concentraties van laminine-1. Verrassenderwijs kunnen verschillende concentraties van hetzelfde molecuul dramatische effectende interne toestand van neuronen en hun celoppervlak samenstelling. Bijvoorbeeld, intracellulaire niveaus van cAMP en maaivelden integrines significant verschillend in neuronen uitgeplaat op beide substraten ^7,8. Aanvullende studies hebben aangetoond dat andere moleculen, waaronder fibronectine en chondroïtinesulfaat proteoglycanen, effect de expressie van celoppervlak moleculen en neuronale motiliteit ^7-11. Bovendien oplosbare moleculen zoals neurotrofinen en neurotropins ook gevolgen celmembraan preparaat en neuronale beweeglijkheid ^12-16 en kan gemakkelijk en nauwkeurig gemanipuleerd in een cel cultuurmodel.

Hier beschrijven we methoden om te isoleren en cultuur los sensorische neuronen van kippenembryo's. Deze procedure is gebruikt om belangrijke doorbraken in neurobiologie, inclusief axon uitgroei ^{5,7,8,10,11,16-21} maken en is een modificatie van een procedure die tot ganglioncellen ²² isoleren. Er zijnverscheidene voordelen aan deze aanpak. Ten eerste zijn veel kenmerken van chick dorsale wortel ganglion (DRG) ontwikkeling goed gekarakteriseerd, waaronder de termijn voor de geboorte, axon extensie, en eiwit expressie profielen ^2,23-28, waardoor het een leerzame basis waarop te bouwen informatieve in vitro experimenten. Ten tweede, gedissocieerd neuronale kweken kan de onderzoeker directer bestuderen neuronen vergelijking met alternatieve benaderingen waarbij intacte DRG-explantaten (welke neuronen en niet-neuronale cellen bevatten) en / of gemengde kweken die zowel gedissocieerde neuronen en niet-neuronale cellen. Ten derde, de hier beschreven procedure is eenvoudig, goedkoop en vatbaar voor studenten. Daarom kan deze techniek worden gebruikt voor onderzoek en voor onderwijsdoeleinden. Bovendien moet kleine wijzigingen van dit protocol snelle, hoge opbrengst zuivering van neuronen uit andere dan DRGs bronnen toestaan. Bijvoorbeeld kan deze procedure worden aangepast om neuronaal verschaffen Enriched kweken van andere weefsels zoals embryonale voorhersenen of ruggenmerg.

Immunocytochemie protocollen zijn geoptimaliseerd voor deze gedissocieerde neuronale kweken en worden in detail beschreven hier. De procedure voor twee immunocytochemie tegen neurale cel adhesiemolecuul (NCAM) en β1 integrines voorzien. Het genereren van deze immunocytochemische werkwijzen zijn gebruikt om de ruimtelijke patronen en intensiteit van verscheidene moleculen in gekweekte neuronen ^8,16 onderzoeken.

Protocol

1 Coverslip Voorbereiding: Acid Wash en Bake Minstens 2 dagen voor dissectie (stap 2), begint de volgende stappen uit om dekglaasjes bereiden. Voer de zure wasstap om oliën en grondig schoon dekglaasjes verwijderen. Load dekglaasjes in porseleinen houder die verticaal positioneert dekglaasjes en voorkomt dat ze elkaar raken. Dompel houder en dekglaasjes in glas histologie container gevuld met 2 M zoutzuur (HCl). Als alternatief, als porselein houder niet beschikbaar, verspreid ~ 20 dekglaasjes hori…

Representative Results

De hier beschreven protocol stelt onderzoekers cultuur een verrijkte populatie van gedissocieerde embryonale sensorische neuronen met zeer weinig (bijvoorbeeld <5%) van niet-neuronale cellen 7,8,10,16. Tal van DRG's kan worden verkregen bij de lumbosacrale, thoracale en cervicale regio. Afhankelijk van de behoeften van de onderzoeker, kunnen DRG's van deze verschillende anatomische gebieden gemakkelijk worden geïsoleerd. Bijvoorbeeld, Figuur 1 toont beelden van het kippen…

Discussion

Hier presenteren wij gedetailleerde protocollen voor het isoleren en kweken los sensorische neuronen van een kippenembryo. Deze procedure genereert een verrijkte populatie van stevig groeiende neuronen in vitro ^7,8,10,16. Vele cellulaire en moleculaire technieken kunnen worden toegepast op deze gekweekte neuronen, waaronder immunocytochemie, die hier wordt beschreven. Dit protocol werd onlangs gebruikt om de intensiteit van immunologisch actieve integrinen sensorische groei kegels ^8,16 kwa…

Materials

sterile small culture dishes (35mm)	Corning	430165
sterile large culture dishes (100mm)	Falcon	353003
sterile large petri dishes (100mm)	VWR	89000-302
glass petri dish (100mm)	VWR	D108962
fine forceps	Fine Science Tools	11251-10
standard forceps	Fine Science Tools	1100-12
coverslips  (22×22)	Fisher	12 518 105K	0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
porcelin coverslip holder	Thomas scientific	8542E40
Fetal Bovine serum	Gibco	17502-048	use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media
HCL	VWR	VW3204-1	use at 2M, can be used twice before discarding
NaCl	Sigma	S9888	use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution
laminin-1	Invitrogen	23017-015	Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul
15 ml conical tube	cell treat	229411
PBS CMF 10X	Gibco	14200	used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water
PBS 10X	Gibco	14080	used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water
Ham's F12	Lonza	12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	10438	use in F12HS20 at 10%
HEPES	Sigma	H3375	make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM
Penicillin streptomyocin	Sigma	P0781	use 5mls in 500mls of F12 media
NT3	Millipore	GF031	Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C  non-defrosting freezer
N2	Invitrogen	17502048	aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,  use 100ul per 10ml of F12H media
NGF	RnD systems	256-GF	Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media
l-glutamine	Sigma	G7513	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media
Trypsin	Sigma	T4049	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	15260
Other items needed:  general dissection instruments, including  glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37  degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose	Sigma	S9378	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Triton-X 100	Sigma	T-8787
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
normal goat serum	Life technologies	PCN500
microscope slides	VWR	16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM	Millipore	AB5032	polyclonal
Antibody against activated beta 1 ingegrin	Millipore	MAB19294	monoclonal
Seconday Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488	Life technologies	A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548	Life technologies	A11036