Isolement et culture de dissocié neurones sensoriels De embryons de poulet

Summary

modèles de culture cellulaire fournissent un contrôle détaillé sur les conditions environnementales et fournissent ainsi une plate-forme puissante pour élucider de nombreux aspects de la biologie des cellules neuronales. Nous décrivons un procédé rapide, peu coûteux et fiable afin d'isoler, de dissocier et de la culture des neurones sensoriels de l'embryon de poulet. Détails de la préparation des substrats et immunocytochimie sont également fournis.

Abstract

Les neurones sont des cellules multiples qui transportent l'information essentielle pour une variété de fonctions, y compris la sensation, le mouvement du moteur, l'apprentissage et la mémoire. Etudier les neurones in vivo peut être difficile en raison de leur complexité, leurs environnements variés et dynamiques, et des limitations techniques. Pour ces raisons, l'étude de neurones in vitro peut s'avérer bénéfique pour percer les mystères complexes de neurones. La nature bien définie de modèles de culture cellulaire un contrôle détaillé des conditions environnementales et des variables. Nous décrivons ici comment isoler, dissocier, et les neurones culture primaires d'embryons de poulet. Cette technique est rapide, peu coûteux, robuste et génère croissance des neurones sensoriels. La procédure produit des cultures qui sont systématiquement hautement enrichies en neurones et a très peu de cellules non-neuronales (moins de 5%). Neurones primaires n'adhèrent pas bien à verre non traité ou la culture de tissus en plastique, donc des procédures détaillées pour créer deux Distinct, bien définie substrats contenant de la laminine-pour le placage neuronale sont décrits. Des neurones en culture sont prête très bien à des techniques moléculaires et cellulaires multiples, y compris la co-immunoprécipitation, imaginer des cellules vivantes, ARNi, et immunocytochimie. Procédures pour le double immunocytochimie sur ces neurones en culture ont été optimisés et décrit ici.

Introduction

Les neurones sont des cellules complexes qui transportent l'information essentielle pour une variété de fonctions, y compris la sensation, la vision, le mouvement du moteur, l'apprentissage et la mémoire. Unique à partir d'autres types cellulaires, les neurones de bras s'étendent processus analogue, appelés axones, pour former des autoroutes neuronaux essentiels pour la communication. Au cours de compartiments de développement spécialisée situés à l'extrémité des axones en croissance, appelé les cônes de croissance, naviguer à travers un concert de signaux extracellulaires de mener l'axone à sa destination appropriée. Les mécanismes moléculaires complexes qui sous-tendent cône navigation de croissance ne sont pas pleinement compris. Pour mieux comprendre ces mécanismes, les chercheurs ont utilisé des modèles de culture cellulaire pour étudier les neurones dans un environnement défini vitro et simplifiée. Etudier les neurones en culture ¹ a permis des avancées significatives dans notre compréhension de la biologie des cellules neuronales, y compris: la différenciation neuronale ^2, la dynamique du cytosquelette, l'endocytose et le trafic, dendritesla réglementation ^3,4, la régénération axonale ^5, et les conditions cliniques telles que les neuropathies ^6. En outre, des neurones en culture sont prêtent très bien à une large gamme de techniques de recherche, y compris immunocytochimie, la surface des cellules co-immunoprécipitation, Western blot, la transfection, l'ARNi et imagerie en temps réel telles que l'analyse de timelapse de la motilité du cône de croissance. Ainsi, la culture de neurones primaires est une approche puissante pour élucider de nombreux aspects de la biologie cellulaire des neurones.

Le modèle de culture cellulaire fournit aux enquêteurs avec un contrôle détaillé sur les conditions environnementales et les variables. Par exemple, le substrat sur lequel les neurones sont étalées (et poussent sur) peut être facilement manipulé. Ici, nous fournissons des instructions détaillées pour produire deux substrats distincts, l'un avec une faible concentration de la laminine-1 et l'autre avec des concentrations saturantes de la laminine-1. De façon surprenante, des concentrations différentes de la même molécule peuvent avoir des effets dramatiquessur l'état interne de neurones ainsi que leur composition de la surface cellulaire. Par exemple, les taux intracellulaires d'AMPc et de surface niveaux de intégrines sont significativement différents dans les neurones étalées sur ces deux substrats ^7,8. D'autres études ont montré que d'autres molécules, y compris la fibronectine et des protéoglycanes chondroïtine sulfate, l'impact de l'expression de molécules de surface cellulaire et la motilité des neurones ^7-11. En outre, les molécules solubles tels que les neurotrophines et aussi l'impact neurotropins composition de la membrane cellulaire et la motilité des neurones et ^{de 12 à 16} peuvent être manipulés facilement et avec précision dans un modèle de culture cellulaire.

Ici, nous décrivons les méthodes pour isoler et culture dissociés neurones sensoriels à partir d'embryons de poulet. Cette procédure a été utilisée pour faire des percées significatives dans la neurobiologie, y compris la croissance axonale ^{5,7,8,10,11,16-21} et a été modifié à partir d'une procédure visant à isoler les cellules ganglionnaires de la ^22. Il y aplusieurs avantages à cette approche. Tout d'abord, de nombreuses fonctionnalités de poussin ganglion de la racine dorsale (DRG) le développement sont bien caractérisés, y compris le délai de naissance, l'extension de l'axone, et les profils d'expression de la protéine ^2,23-28, fournissant ainsi une base instructive sur laquelle construire informative des expériences in vitro. Ensuite, les cultures neuronales dissociées permettent le chercheur d'étudier plus directement les neurones par rapport à d'autres approches utilisant des explants de DRG intacts (qui contiennent des neurones et des cellules non-neuronales) et / ou des cultures mixtes contenant à la fois des neurones dissociés et les cellules non-neuronales. Troisièmement, la procédure décrite ici est simple, peu coûteux et se prêtent à de premier cycle. Par conséquent, cette technique peut être utilisée pour la recherche ainsi qu'à des fins d'enseignement. En outre, des variations mineures de ce protocole devraient permettre rapide, à haut rendement purification des neurones à partir de sources autres que les DRG. Par exemple, cette procédure peut être modifiée pour fournir neuronale enriched cultures provenant d'autres tissus tels que le cerveau antérieur ou de la moelle épinière embryonnaire.

protocoles de immunocytochimie ont été optimisés pour ces cultures neuronales dissociées et sont décrits en détail ici. La procédure de double-immunocytochimie contre neural molécule d'adhésion cellulaire (NCAM) et β1 des intégrines est fourni. Les données produites par ces méthodes immunocytochimiques ont été utilisées pour examiner la structuration spatiale et d'intensité de plusieurs molécules dans des neurones en culture ^8,16.

Protocol

1 lamelle Préparation: Laver acide et Cuire Au moins 2 jours avant la dissection (étape 2), commencer les étapes suivantes pour préparer lamelles. Effectuer l'étape de lavage à l'acide pour éliminer les huiles et les lamelles de nettoyer à fond. lamelles de charge en support de porcelaine qui positionne verticalement lamelles et les empêche de toucher l'autre. Immerger support et des lamelles dans un récipient d'histologie de verre rempli d'acide chlorhydrique 2 M (HCl)…

Representative Results

Le protocole décrit ici, les enquêteurs de la culture une population enrichie de neurones sensoriels embryonnaires dissociées avec très peu de cellules (par exemple, <5%) non-neuronales 7,8,10,16. De nombreux GHM peuvent être obtenues auprès du lombo-sacrée, thoracique et cervical. Selon les besoins de l'enquêteur, les GHM de ces régions anatomiques distinctes peuvent être facilement isolés. Par exemple, la figure 1 montre des images de l'embryon de poulet à tr…

Discussion

Nous présentons ici des protocoles détaillés pour l'isolement et la culture dissociés neurones sensoriels d'un embryon de poulet. Cette procédure génère une population enrichie de neurones croissance robuste in vitro ^7,8,10,16. De nombreuses techniques moléculaires et cellulaires peuvent être appliqués à ces neurones en culture, y compris l'immunocytochimie, qui est décrit ici. Ce protocole a été récemment utilisée pour évaluer quantitativement l'intensité des intég…

Materials

sterile small culture dishes (35mm)	Corning	430165
sterile large culture dishes (100mm)	Falcon	353003
sterile large petri dishes (100mm)	VWR	89000-302
glass petri dish (100mm)	VWR	D108962
fine forceps	Fine Science Tools	11251-10
standard forceps	Fine Science Tools	1100-12
coverslips  (22×22)	Fisher	12 518 105K	0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
porcelin coverslip holder	Thomas scientific	8542E40
Fetal Bovine serum	Gibco	17502-048	use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media
HCL	VWR	VW3204-1	use at 2M, can be used twice before discarding
NaCl	Sigma	S9888	use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution
laminin-1	Invitrogen	23017-015	Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul
15 ml conical tube	cell treat	229411
PBS CMF 10X	Gibco	14200	used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water
PBS 10X	Gibco	14080	used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water
Ham's F12	Lonza	12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	10438	use in F12HS20 at 10%
HEPES	Sigma	H3375	make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM
Penicillin streptomyocin	Sigma	P0781	use 5mls in 500mls of F12 media
NT3	Millipore	GF031	Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C  non-defrosting freezer
N2	Invitrogen	17502048	aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,  use 100ul per 10ml of F12H media
NGF	RnD systems	256-GF	Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media
l-glutamine	Sigma	G7513	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media
Trypsin	Sigma	T4049	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	15260
Other items needed:  general dissection instruments, including  glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37  degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose	Sigma	S9378	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Triton-X 100	Sigma	T-8787
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
normal goat serum	Life technologies	PCN500
microscope slides	VWR	16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM	Millipore	AB5032	polyclonal
Antibody against activated beta 1 ingegrin	Millipore	MAB19294	monoclonal
Seconday Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488	Life technologies	A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548	Life technologies	A11036