세포 배양 모델은 환경 조건 위에 상세한 제어를 제공하고, 따라서 신경 세포 생물학의 다양한 양상을 명료하게 강력한 플랫폼을 제공한다. 우리는 병아리 배아에서 감각 신경을 분리 해리, 문화 할 수있는 신속하고 저렴하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 하층 준비 및 면역 세포의 세부 사항도 제공됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
뉴런은 감각, 운동 모터, 학습 및 메모리를 포함하는 다양한 기능을위한 필수적인 정보를 전달 다각적 세포이다. 생체 내에서 뉴런을 공부하는 것은 그들의 복잡성, 그들의 다양하고 역동적 인 환경 및 기술적 한계에 도전 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 시험 관내에서 신경 세포를 연구하는 신경 세포의 복잡한 신비를 푸는 유익한 증명할 수 있습니다. 세포 배양 모델의 잘 정의 된 자연 환경 조건과 변수를 통해보다 정밀하게 제어 할 수 있습니다. 여기에서 우리는, 분리 해리, 그리고 병아리 배아에서 배양 주 뉴런하는 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 급속 저렴하고 견고 감각 신경 성장 생성한다. 절차는 지속적으로 높은 신경 세포에 충실 문화를 생산하고 거의 비 신경 세포 (5 % 미만)이 있습니다. 차 뉴런 따라서 자세한 절차는이 디스탱을 만들, 치료 유리 또는 조직 배양 플라스틱에 잘 고착되지 않습니다CT, 신경 도금 잘 정의 된 라미닌 함유 하층 설명한다. 배양 된 신경 세포 공동 면역 침전, 라이브 셀 상상, RNAi를하고, 면역 세포 등 다양한 세포 및 분자 기술에 매우 의무가 있습니다. 이 배양 된 신경 세포를 두 번 면역 세포 화학에 대한 절차 최적화 여기에 설명되어있다.
서론
뉴런은 감각, 비전, 모터 운동, 학습 및 메모리를 포함하는 다양한 기능에 필수적인 정보를 전달 복잡한 세포입니다. 다른 세포 유형에서 독특한는 뉴런 통신에 필수적인 신경 도로를 형성하도록, 아암 형상 프로세스라는 축삭을 연장. 성장 축삭의 끝에있는 개발 전문 구획 동안의 적절한 대상으로 축삭을 이끌 세포 외 신호의 콘서트를 탐색, 성장 콘을했다. 성장 콘 탐색의 기초가 복잡한 분자 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 더 나은 이러한 메커니즘을 이해하기 위해, 연구자들은 정의의 단순화 된 체외 환경에서 뉴런을 연구하기 위해 세포 배양 모델을 사용하고 있습니다. 신경 세포의 분화 2, 세포 골격 역학, 엔도 시토 시스와 인신 매매, 덴 드라이트 (dendrite) : 문화 1에서 공부 뉴런을 포함, 신경 세포 생물학에 대한 우리의 이해에 상당한 발전을 주도하고있다규제 3,4, 축삭 재생 5, 및 신경 병증 6 임상 조건. 또한, 배양 된 신경 세포는 면역 세포, 세포 표면 공동 - 면역 침전, 웨스턴 블롯, 형질 감염, RNAi에, 이러한 성장 콘 운동성 인터벌 분석과 같은 라이브 영상을 포함한 연구 기법의 넓은 범위에 높은 의무이다. 따라서, 차 뉴런을 배양하....
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프로토콜
1 커버 슬립 준비 : 산 세척 및 구워
- 최소 2 일 전에 해부 (2 단계)로 된 커버를 준비하려면 다음 단계를 시작합니다. 오일과 철저하게 청소 된 커버를 제거 할 수있는 산 세척 단계를 수행합니다.
- 수직으로 된 커버를 배치하고 서로 닿지에서 그들을 방지 도자기 홀더에로드 된 커버. 2 M 염산 (HCL)로 채워진 유리 조직 학적 용기에 홀더와 커버 슬립을 담근다. 도자기 홀더를 사용할 수없는 경우 또는, 100mm 유리 페트리 접시의 바닥을 커버하고 2 M 염산에 커버 슬립 잠수함 20 커버 슬립 수평 ~ 퍼졌다.
- 흄 후드에서 로커 테이블 (산에 침수 된 커버와 함께) 유리 용기를 놓고 실온에서 적어도 5 시간 동안 락을 부드러운 수 있습니다. 또한, 산 세척 하룻밤 동일한 조건으로 된 커버.
- 도자기 홀더로드 전송하여 증류수 H 2 O DH (2 O)로 된 커버를 세척dH보다 2 O. 가득 깨끗한 유리 조직학 컨테이너에 2 M 염산에서 커버 슬립과 함께 또한, 커버 슬립 유리 페트리 접시에서 2 M 염산을 가만히 따르다 및 dH보다 2 O.로 리필
- 다시 dH보다 2 O 경사 분리와 신선한 dH보다 <....
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결과
여기에 설명 된 프로토콜은 문화에 거의 (예를 들어, <5 %) 비 신경 세포 7,8,10,16와 해리 배아 감각 뉴런의 풍부한 인구를 수사 할 수 있습니다. 수많은 DRGs는 요천 추부, 흉부 및 경부 지역에서 얻을 수 있습니다. 연구자의 필요에 따라 이러한 독특한 해부학 적 영역에서 DRGs를 쉽게 분리 할 수있다. 예를 들어, 그림 1은도 1C 및 1D 및도 1E와 1 층에서 흉부 DRGs 강조 요추 DRGs와 절개의 다양한 단계를 통해 병아리 배아의 이미지를 보여줍니다.
배양 된 세포는 쉽게 면역 세포에 의해 표시된다. 여기에서, 배양 된 세포는 β1 인테그린 및 NCAM (그림 2)에 대한 항체와 면역 염색된다. 놀랍게도, 우리는이 후 최대 일년에 형광 염색을 시각화 할 수있었습니다ICC 절차, 슬라이드는 4 ° C에서와 어둠 속에서.......
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토론
여기에서 우리는 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제시하고 배양은 병아리 배아에서 감각 신경 해리. 이 절차는 시험 관내 7,8,10,16의 고성장 신경 세포의 풍부한 인구를 생성합니다. 다수의 세포 및 분자 기술들은 여기에 설명 된 면역 세포를 포함하여 이들 배양 된 신경에 적용 할 수있다. 이 프로토콜은 최근 정량적 감각 성장 콘 8,16에서 immunolabeled 인테그린 활성화의 강도를 평가하기 위해 사용되었다. 이러한 선행 연구에서, 소프트웨어 프로그램이 정확하게 성장 원추의 원위 단부 20 미크론의 윤곽을 생성하기 위해 사용되었다. 개요는 NCAM 염색을 기반으로 만들어졌다. 뉴런의 NCAM 유비쿼터스 표현은 전체 성장 원추보다는 성장 원추의 제한된 부분을 식별하기 위해 소프트웨어 프로그램을 사용 가능. 이러한 성장 원뿔 윤곽이어서 관심 영역과 그 REGI 내 인테그린 염색 강도로 확인되었다관심에 소프트웨어에 의해 평가되었다. 이러한 방식으로, 목적 단백질의 강도.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
우리는이 논문에 대한 통찰력있는 의견을 앨리슨 Philbrook, 벨린다 Barbagallo 마이클 프랜시스에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 책에서보고 된 연구는 MLL에게 수여 R15 AREA 상 1R15NS070172-01A1에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 멸균 소형 배양 접시 (35mm) | Corning | 430165 | |
| 멸균 대형 배양 접시 (100mm) | Falcon | 353003 | |
| 멸균 대형 페트리 접시 (100mm) | VWR | 89000-302 | |
| 유리 페트리 접시 (100mm) | VWR | D108962 | |
| 파인 파이치 | 파인 사이언스 도구 | 11251-10 | |
| 표준 집게 | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| 커버슬립(22 x 22mm) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17mm 두께는 현미경 검사에 최적 |
| 포셀린 커버슬립 홀더 | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | 500ml당 50ml 분취액 사용 |
| 2M에서 사용, | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | Laminin-1 재고 용액 |
| Laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | 사용하십시오. 72 µ를 추가하십시오. 멸균 5 M NaCl의 l과 50 µ로 분취량; l |
| 15ml 원뿔형 튜브 | 세포 치료 | 229411 | |
| PBS CMF 10x | Gibco | 14200 | 1x에서 사용, 멸균 Millipore 여과수 |
| PBS 10x | Gibco | 14080 | , 멸균 Millipore 여과수로 희석 |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| 태아 소 혈청 알부민(BSA) | Gibco | 10438 | 10 % |
| HEPES | 시그마 | H3375 | F12HS20 사용하여 증류수에 멸균 1M 용액을 만들고 F12 매체에 희석하여 10 mM |
| 페니실린 / 스트렙토 마이오신 | 시그마 | P0781 | 500 ml의 F12 매체 |
| NT3 | Millipore | GF031 | 에 5ml를 사용합니다.멸균 Millipore 물 1ml를 추가하고, 멸균 조건에서 분취액을 넣고 -20°C에서 보관하십시오. C, F12H 매체에서 10 ng / ml의 최종 농도에서 사용, -20 °C로 유지; C 비제상 냉동고 |
| NGF | RnD 시스템 | 256-GF | 0.1% BSA가 함유된 멸균 1x PBS 1ml를 추가하고 멸균 조건에서 분취액을 넣고 -20°C에서 보관합니다. 멸균 조건에서 F12H 배지 |
| L-글루타민 | 시그마 | G7513 | 는 -20°C에서 보관합니다. C, 멸균 조건 하에서 F12H 매체 |
| Trypsin | Sigma | T4049 | , -20 °C에서 보관; C |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Gibco | 15260 | |
| 기타 필요한 품목: 유리 파스퇴르 피펫, 비옥한 흰 다리뿔 닭 달걀, 체크 알 부화기(가습, 37 ° C), 세포 배양 챔버 (가습, 37 ° C), 층류 후드, 양안 입체 비전 해부 범위 | |||
| Immunocytochemistry 시약 표 | |||
| Sucrose | Sigma | S9378 | (4% 파라포름알데hye, 30% 자당, 2x PBS) |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| 파라포름알데히드 | Sigma | P6148 | 고정액에 사용 (4% 파라포름알데히, 30% 자당, 2x PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-430 | |
| Primary 항체 Table | |||
| 항체 against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
| 항체 활성화됨 & 베타; 1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
| Secondary 항체 Table | |||
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| 염소 anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 |
참고문헌
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
- Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L.
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