Simple Plan Illumination module et l'approche micro-capillaire pour un microscope à grand champ
Summary
Un module de plan unique éclairage microscopie (SPIM) est décrit qui est facilement adapté à un microscope à grand champ inversé et optimisée pour des cultures de cellules en 3 dimensions. L'échantillon se trouve à l'intérieur d'un capillaire rectangulaire, et par l'intermédiaire d'un micro-fluidiques colorants fluorescents de système, des agents pharmaceutiques ou des médicaments peut être appliquée dans de petites quantités.
Abstract
Un module de nappe de lumière ou un seul plan illumination microscopie (SPIM) est décrit qui est facilement adapté à un microscope à grand champ inversé et optimisée pour des cultures de cellules en 3 dimensions, par exemple, sphéroïdes tumoraux multicellulaires (SCTM). Les formes de modules SPIM d'excitation et dévie la lumière de telle sorte que l'échantillon est illuminé par une nappe de lumière perpendiculaire à la voie de détection du microscope. Le système est caractérisé par l'utilisation d'un capillaire rectangulaire pour contenir (et dans une version améliorée aussi par une méthode de micro-capillaire pour faire tourner) des échantillons, par le réglage synchrone de la feuille de lumière d'éclairage et la lentille d'objectif utilisé pour la détection de la fluorescence ainsi que par l'adaptation d'un système microfluidique pour l'application de colorants fluorescents, des agents pharmaceutiques ou des médicaments dans de petites quantités. Un protocole pour travailler avec ce système est donnée, et certains détails techniques sont signalés. Les résultats représentatifs comprennent (1) la mesure de la placeprendre un médicament cytostatique (doxorubicine) et sa conversion partielle en un produit de dégradation, (2) des mesures rédox par l'utilisation d'un capteur de glutathion génétiquement codé lors de l'addition d'un agent oxydant, et (3) l'initiation et l'étiquetage de nécrose cellulaire sur l'inhibition de l' la chaîne respiratoire mitochondriale. Les différences et les avantages du module de SPIM présente en comparaison avec les systèmes existants sont discutés.
Introduction
En plus des méthodes bien établies (confocale ou multi-photons microscopie à balayage laser 1-4, structuré éclairage microscopie 5,6) feuilles microscopie optique ou d'éclairage de plan unique (SPIM) s'est avérée être une méthode valable de l'imagerie 3D 7,8, 9. Il est particulièrement intéressant de son application à des cultures de cellules en 3 dimensions, par exemple, sphéroïdes tumoraux multicellulaires (SCTM), qui sont utilisés de plus en plus à la recherche de découverte de médicaments 10,11. En outre, SPIM est une méthode préférentielle quand même lors de l'exposition à long terme ou des mesures répétitives doses de faible éclairage sont nécessaires pour maintenir la viabilité de l'échantillon, car pour la mesure de chaque plan de l'échantillon que ce plan est exposé à la lumière. Ceci est en contraste avec d'autres techniques de microscopie, où pour la détection de chaque plan focal de la totalité de l'échantillon est illuminé, de sorte que lors de l'enregistrement de plusieurs plans les sommes de la dose de lumière et peut endommager l'échantillon 12. </p>
Microscopie à lumière ou SPIM feuille est basée sur un éclairage de l'échantillon en direction perpendiculaire au trajet d'observation, soit par l'utilisation d'une lentille cylindrique ou par balayage du faisceau laser d'excitation (pour une revue, voir Ref. 8). Cela exige souvent des chambres d'échantillons spéciaux 13,14 ou des matrices, par exemple, de l'agarose 7,15, mis en œuvre dans des microscopes spéciaux à coût élevé. Comme alternative à ces systèmes un dispositif d'éclairage simple, comparable à SPIM a été développée et adaptée à un microscope inversé conventionnel 16 (voir figure 1). Il se compose d'un faisceau laser dilaté à un diamètre de 8 mm et focalisé par une lentille cylindrique (distance focale: 50 mm, ouverture numérique: 0,08) à une nappe de lumière de 6 à 10 um d'épaisseur sur une profondeur de champ d'environ 100 um . Les échantillons sont placés dans un tube capillaire rectangulaire de 600 à 900 um de diamètre interne placé à l'avant de l'objectif len microscopes pour la détection de fluorescence. Ces caractéristiques principales sont actuellement remplis et optimisés par l'utilisation de méthodes de micro-capillaires de pointe pour maintenir et pour faire tourner les échantillons, le réglage synchrone de la feuille de lumière d'éclairage (en direction axiale) et la lentille d'objectif utilisé pour la détection de fluorescence (de chemin optique identique des longueurs de déplacement nécessitent une correction de la charge mécanique), et l'adaptation d'un système microfluidique pour l'application de colorants fluorescents, des agents pharmaceutiques ou des médicaments, réduisant ainsi les quantités et les charges requises.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le présent manuscrit décrit une nappe de lumière ou simple microscopie plan d'éclairage (SPIM) dispositif qui est optimisé pour les systèmes cellulaires en 3 dimensions, par exemple sphéroïdes multicellulaires tumorales (SCTM). Trois exemples d'applications sont (1) l'absorption d'un médicament cytostatique et sa conversion partielle à un produit de dégradation (dont la contribution à l'efficacité chimiothérapeutique reste encore à évaluer), (2) les mesures de l'…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été financé par le Land de Bade-Wurtemberg ainsi que par l'Union européenne, Europäischer Fonds für die Entwicklung Regionale. Les auteurs remercient Rainer Wittig (ILM Ulm) pour fournir la lignée cellulaire U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 et Claudia Hintze d'assistance technique habile.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description(optional) |
| microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | for cell spheroid growing |
| agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | for cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | cell line |
| U251-MG-L106 cell line | cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | cell culture supplement |
| penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | antibiotics |
| hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | cell culture supplement |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox – fluorescent cytotoxicity dye |
| rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| capillary | VitroCom | 8260-050 | sample preparation |
| microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | used with driver PDL800-B |
| perestaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
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