Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células
Summary
Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.
Abstract
HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.
Introduction
Humana tipo 1 del virus de inmunodeficiencia (VIH-1) de entrada, mediada por las glicoproteínas de la envoltura viral triméricos (ENV) es el primer paso del ciclo infeccioso. Siendo el único antígeno viral expuesto presentado en la superficie de los viriones, la Env trímero provoca anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes. Como tal, representa un candidato interesante para el diseño inmunógeno de la vacuna. Sin embargo, los ensayos de vacunación con Env en formas solubles o recombinantes suscitó respuestas con sólo una eficacia mínima contra más primaria del VIH-1 aislados de 1-3. No obstante, la eficacia parcial observada en el ensayo de la vacuna RV144 4 renovado interés en el VIH-1 Env como candidato inmunógeno. Esto fue corroborado por un reciente estudio describiendo que los anticuerpos anti-Env vacuna-suscitó fueron suficientes para generar un cierto grado de protección contra el VIS y el VIH desafía 5.
Después de ser sintetizada en el retículo endoplásmico, el glycoprote Enven precursora, gp160, experimenta varias modificaciones post-traduccionales que son críticos para su capacidad para alimentar el proceso de fusión viral. El precursor de Env debe doblar correctamente y asociado en trímeros antes de ser escindida en sus gp120 y gp41 transmembrana extra-citoplasmáticos subunidades 6-10, con interacciones no covalentes que mantienen el enlace con gp120-gp41. La maquinaria de la célula infectada también es en gran medida responsable de glicosilar Env, que comprende aproximadamente 50% de su masa total 11,12. La compleja estructura resultante permite Env para ser conformacionalmente flexible de 13,14, mientras que proporciona una metaestabilidad que se piensa para permitir Env para adaptarse y ocultar ciertos epítopos altamente inmunogénicos que de otro modo estar expuestos 15-19, subrayando la importancia de comprender mejor las diferentes conformaciones muestreada por el trimer Env nativa.
Hasta la fecha, varias técnicas se han desarrollado y utilizado con éxito para estudiar Env ch conformacionalanges. Sin embargo, varían en sus limitaciones, está a menudo restringido a contextos específicos Env. Por ejemplo, la resonancia de plasmón de superficie o ensayos de inmunoprecipitación utilizando anticuerpos monoclonales específicos de conformación (mAbs), se basan ya sea en moléculas Env solubles o solubilizados monoméricas que se sabe que son inmunogenéticamente diferentes de sus formas triméricas 20,21. Estudios recientes también sugieren que la escisión afecta conformaciones resultantes Env en la exposición de los epítopos reconocidos principalmente por anticuerpos no neutralizantes 14,22,23.
A continuación se describe en detalle un método que permite la determinación rápida y fácil de la conformación de celularmente-expresado Env trímeros 18,24-26. Después de la transfección transitoria de Env en una línea de células adherentes humana la unión de los anticuerpos de Env-específicos se detecta utilizando una reacción de quimioluminiscencia simple. Esta técnica también se puede utilizar para caracterizar la preferencia conformacional de conformación depen-anticuerpos abolladura. Por lo tanto, este ensayo proporciona un método robusto y altamente flexible de detección.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este ensayo se optimiza para detectar la interacción de los mAb específicos con el VIH-1 trimérica Env expresada en la superficie celular. Una vez que el protocolo ha sido establecida, puede ser utilizado en medios a altos rendimientos con bajos costes de materiales globales y pequeñas cantidades de anticuerpos. Dado que este ensayo está basado en la transfección, puede ser fácilmente adaptado para la coexpresión de las proteínas celulares tales como CD4 con el fin de estudiar sus efectos sobre la conformación…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. James Robinson por su generosa donación de la A32, 17b, 48d, y C11 mAbs. PGT 121 se obtuvo a través del Programa de reactivos de SIDA de los NIH, la División de SIDA, NIAID, NIH (Cat # 12343). Este trabajo fue apoyado por la Fundación Canadiense para la Innovación Líder del Programa # 29866, por un operativo CIHR # 257792, por un Establecimiento FRQS de Joven Científico Grant # 24639 de la FA y por un subsidio continuo CRCHUM, así como por un CIHR subvención catalizador # 126630 a AF y RM. AF es el destinatario de un FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 beca # 24639. MV fue apoyado por un Premio de Investigación Doctoral CIHR # 291485.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96 well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-Human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
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