Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.
Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.
거기 쌍 및 조직에서 ororgan 병변 무기력하고, 경우에 치명적인 때문에 의학 목적의 것으로 이루어진다 tissuesis 하나의 재생. 맥락에서, 건강 노동자들과 연구자들은 지속적으로 새로운 치료 alternativesto가 손상 조직의이 쌍 – 재생 과정을 촉진 제공하는 기술, 방법 및 도구를 찾고있다. 이 세포 계보, 조직 재생 과정을 연구하는 이상적인 모델을 나타내고 있기 때문에, 생의학는 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로 분화 할 가능성이 높기 때문에에, 중간 엽 줄기 세포 (MSC들), 특히 성체 줄기 세포에 대한 연구에 초점을 맞추었다 세포 계통은 다소 MSC들과 현실을 치료하기 위해, 중간 엽 줄기 세포의 thetherapeutic 전위 특성은 숙주 조직에서 중간 엽 줄기 세포의 원하는 동작을 보장 생체 재료 및 셀룰러 비계를 이용하여 새로운 세포 배양 기술의 구현을 수반한다.
<p클래스 = "jove_content"> 골 재생에서 중간 엽 줄기 세포와 배양 구현 극복하는 주요 과제는 일반적으로 사용 된 마이크로 미터부터 밀리미터까지의 기공 adistribution 가진 다공성 구조를 제공 선택된 생체 물질에 세포 접착 성을 확보하는 것이다 그러나 자주 세포의 복잡한 동작을 변경 시약, 장비 및 절차를 요구한다. 이러한 절차는하지만 인간이나 생체 분석에 복잡한 오픈 시스템에서 외삽 및 구현, 시험 관내 추정에 적합하다. 다공성 뼈 물질과 같은 임의의 지형에 세포 부착을 보장 초점 기술들이 배양 웰의 바닥에 재료의 접착에 의해 연구 및 콜라겐 아가 로스 중합체를 이용되어왔다. 이러한 방법의 경우, 표면 상에 시딩 된 셀 기공 및 상부면 상에 보유 하였다. 그러나, 이러한 양태는 생체 내에서 확보 할 수없는생체를 둘러싸 체액 다공성 지지체의 원하는 위치에서 셀을 드래그 할 수있는 시스템은 복잡한 장비가 필요하지만, 시험관 내 어 세이 (5)에 조골 세포 마커의 발현을 촉진 초음파 자극의 사용이다. 연속 배양의 사용은 배양 배지 내 영양분의 균질 분포를 보장 생물 반응기를 필요로; 이에 기술과 설비의 벽에 부착 매체에서 사용되는 유량 배지 교체시 그러나, 배양 된 세포의 상당한 비율이 손실된다. 이러한 문제는 이러한 유형의 배양 세포 (7)의 충분한 수를 얻기위한 시간이 필요하다 세포 질량을 증가시킨다. 따라서, 본 연구에서 제시된 방법은 세포가 상면 물질 상에 마이크로 질량 시딩 때문에 생체 시스템으로 외삽되어야 기법을 나타내고, 이후 appropri배양 시간을 먹었다, 초기 세포 질량의 60 %가 부착된다. NKB는 osteoconductive 및 골 유도 골격 8 방법이기 때문에 또한,이 기술은 골아 인덕터 (예를 들면, 덱사메타손, 아스코르브 산, 베타 – 글리세로 포스페이트) 또는 조골 세포 분화 및 골 세포 표현형의 유지를 유도하는 초음파 자극의 첨가를 필요로하지 않는다 손상된 뼈 조직에 세포를 삽입하고 조골 세포 계보로 분화를 유도하기 위해이 작업 representsapossibility에서 제시 거대 다공성 뼈 생체 재료에 인간 양막 (AM-중배엽 줄기 세포)에서 중간 엽 줄기 세포의 배양.양막 (도 1)로부터 수득 된 줄기 세포는 섬유 아세포와 같은 형태, 중간 엽 세포와 유사한 (도 2) 중간 엽 줄기 세포 주로 보여주고 있었다. 또한, 유동 세포 계측법 분석은 이러한 세포는 조혈 계통 마커 (CD34, CD45) (그림 3)에 대한 중간 엽 세포 마커 (CD73, CD90, 및 CD105) 양성 및 음성 인 것으로 나타났습니다. 또한,이 연구에서 고립 된 AM-중배엽 줄기 세포는 CFUs (그림 6)를 형성하는 능력을 제시한다. 마찬가지로,이 양식에 고립 된 중간 엽 줄기 세포는 (그림 5) osteoinductor의 생체 재료 (그림 4)에 연결하고, 발판에 증식 할 수있는 능력을 유지했다.
이러한 이유로,이 연구에서 사용 된 거대 다공성 뼈 생체 재료에 AM-중배엽 줄기 세포의 배양 방법은 손상된 뼈 조직 내의 세포를 삽입 한 differe을 유도 할 수있는 기회를 나타낸다조골 세포 혈통에 ntiation. 이 배양 시스템은 NKB는 osteoconductive andosteoinductive 재료 (8) 때문에 조골 세포 및 조골 세포의 표현형 분화 과정을 유지하기 위해 골아 인덕터의 첨가를 필요로하지 않는다. 인간 태반 등 폐 조직의 사용은 빈번 침습적 방법 또는 낮은 셀 수율 관련된 다른 소스와 비교하여, 중간 엽 줄기 세포로 분화하는 잠재력을 가진 줄기 세포 집단에 액세스하기 위해 간단하고 윤리적 대안을 나타낸다.
셀이 상부 표면 물질 상에 마이크로 질량 시딩 때문에 제안 배양법 생체 시스템으로 외삽 될 수 있으며, 세포에 정착하고 적절한 배양 시간 후에 전체 바이오 물질의 표면에 부착. 이 기술을 구현할 때 또한, 정교한 시약, 장비 및 절차로도 기존의 방법과는 달리, 마이크로 질량 cultureas을 아르 필요하지 않습니다재료에 세포 나누어지는 느리고 꾸준한 침착은 세포가 우선적으로 판의 바닥에 바이오 물질과 상호 작용하지 않도록합니다. 이것은 그들이 표면 또는 세공 내에 있으면 이들이 관계없이 재료에 통합 될 때 세포가 배양 배지에서 필요한 영양분을 가질 것을 보장로서 또 다른 중요한 점은, 세포를 배양하기 전에, 먼저 습윤 물질의 사용이다. 이 유도 및 골아 분화를 유지하기 위해 외부 요인의 첨가를 피할 수 있기 때문에 최종적으로, 골 유도 생체 물질의 사용은이 프로세스에 중요하다. 기술의 한계가 소 행렬의 전위에 기초하여 골 유도된다는 것이다; 그러나, 제안 된 배양 시스템은 20 ~ 200㎛의 기공 분포 어떠한 다공질 재료에 외삽 될 수있다. 따라서, 본 연구에 제시된 절차는 다양한 재료 t에서 중간 엽 줄기 세포를 배양하기위한 다른 방법은모자는 특히 뼈 재생을 위해, 조직 공학을 위해 사용된다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 장학금과 Consejo 나시 오날 드 Ciencia y를 TECNOLOGIA (CONACYT No.49887), Facultad 드 Medicina – UNAM DGAPA IN201510과 DGAPA IN216213에서 제공하는 재정 지원을 인정; 생체 물질에 대한 도움말 연구소의 나시 오날 드 Perinatología의 살바도르 코레아; Nukbone을 기부하고 Biocriss, SA 드 C. V. 또한 잉에 감사드립니다. IIM, UNAM의 헥터 마르티네즈 및 기술 지원을 CINVESTAV의 M EN C 파비 곤잘레스.
sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
3mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
trypsin/0.5mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |