Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.
Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.
Det ihop och förnyelse av tissuesis en av themain mål medicinsk vetenskap eftersom en skada i en vävnad ororgan kan vara förlamande och, i vissa fall, dödliga. I sammanhanget är vårdpersonal och forskare ständigt söker tekniker, metoder och verktyg för att ge ny terapeutisk alternativesto främja det pair-regenereringsprocess av skadad vävnad. Därför har biomedicinska vetenskaperna inriktats på studier av mesenkymala stamceller (MSCs), särskilt vuxna stamceller, eftersom denna cellinje utgör en idealisk modell för att studera vävnadsregenereringsprocessen, på grund av dess potential att differentieras till ektodermalt, mesodermalt och endodermalt cellinjer Men för att göra behandlingen med MSC verklighet måste karakterisering av thetherapeutic potential MSC åtföljas av införandet av nya cellodlingstekniker använder biomaterial och cell byggnadsställningar som garanterar önskat beteende MSC i värdvävnaden.
<pclass = "jove_content"> Den främsta utmaningen att övervinna i genomförandet av en kultur med MSC i benuppbyggnad är att säkra celladhesion på vald biomaterial, som i allmänhet uppvisar en porös struktur med adistribution av porer som sträcker sig från mikrometer till millimeter har använts men ofta kräver avancerade reagenser, utrustning och rutiner som förändrar beteendet hos celler. Dessa förfaranden är lämpliga för in vitro-uppskattning, men inte för de extrapolering och genomförande i komplexa öppna system, såsom människor eller in vivo-analyser. Tekniker som fokuserar på att säkerställa celladhesion till slump topografier, såsom porösa benmaterial, har studerats av vidhäftningen av materialet till botten av odlingsbrunnar och sysselsatte kollagener och agaros polymerer. För dessa metoder, var de celler som såddes på ytan kvarhålles i porerna och på den övre ytan. Dock kan denna aspekt inte säkerställas i en in vivosystemet, där kroppsvätskor som omger biomaterial kunde dra cellerna från den önskade platsen på porösa byggnadsställningar är användningen av ultraljud stimulering, vilket kräver avancerad utrustning men främjar uttrycket av osteoblastiska markörer i in vitro-analyser 5. Användningen av kontinuerliga kulturer kräver bioreaktorer, som garanterar en homogen fördelning av näringsämnen i odlingsmediet; emellertid en betydande andel av de odlade cellerna förlorade vid byte av odlingsmediet på grund av att flödeshastigheten som används i denna teknik och mediet som vidhäftar till väggarna i utrustningen. Dessa frågor ökar cellmassan som är nödvändig för denna typ av kultur och tiden för att erhålla ett tillräckligt antal celler 7. Således, den metod som presenteras i detta arbete representerar en teknik som skulle kunna extrapoleras till in vivo-system eftersom cellerna ympas i mikro-massa på en toppyta material, och efter lämpåt inkubationstider, är 60% av den ursprungliga cellulära massan vidhäftat. Dessutom inte denna teknik inte kräver tillsats av osteoblastiska induktorer (t.ex. dexametason, askorbinsyra, eller beta-glycerofosfat) eller ultraljuds stimuli för att inducera osteoblastisk differentiering och underhåll av osteoblaster fenotyp eftersom NKB är en osteokonduktiv och osteoinducerande byggnadsställningar 8, metoden för odling av MSCs från human fosterhinnan (AM-hMSCs) på makroporös biomaterial ben som presenteras i detta arbete representsapossibility att infoga celler i skadad benvävnad och inducerar differentiering till osteoblastisk härstamning.De stamceller som erhölls från human fosterhinnan (Figur 1) visade en fibroblast-liknande morfologi, liknande mesenkymala celler (Figur 2) och var huvudsakligen MSC. Dessutom flödescytometri analyser visade att dessa celler var positiva för mesenkymala cellmarkörer (CD73, CD90, och CD105) och negativ för hematopoetiska härstamning markörer (CD34, CD45) (Figur 3). Även AM-hMSCs isolerade i detta arbete presenterar förmågan att bilda CFU (Figur 6). Likaså de mesenkymala stamceller som isoleras i denna form bibehöll förmågan att fästa till osteoinductor biomaterial (Figur 4), och proliferera på ställningen (fig 5).
Av dessa skäl, kulturen metoden AM-hMSCs på makroporös ben biomaterial som användes i detta arbete utgör en möjlighet att infoga celler i skadade benvävnad och inducera sin differentiation till den osteoblastiska härstamning. Denna kultur systemet kräver inte tillsats av osteoblastiska induktorer att bibehålla osteoblast fenotypen och osteoblastiska differentieringsprocess eftersom NKB är ett osteokonduktivt andosteoinductive materialet 8. Användningen av avfallsvävnader, såsom human placenta, representerar en enkel och etisk alternativ för att komma åt en population av stamceller med potential att differentiera till MSC, i jämförelse med andra källor som ofta involverar invasiva metoder eller låg cellutbyte.
Den föreslagna odlingsmetod kunde överföras till in vivo-system eftersom cellerna ympas i mikro-massa på den övre ytan materialet, och cellerna koloniserar och vidhäftar till hela biomaterialytan efter lämpliga inkubationstider. Dessutom är sofistikerad reagenser, utrustning och rutiner krävs inte, till skillnad från befintliga metoder vid genomförandet av denna teknik är de mikro massa cultureas samtlångsam och stadig avsättning av den cellulära alikvot på material för att säkerställa att cellerna preferentiellt interagerar med biomaterialet, och inte med botten av plattan. En annan kritisk punkt är användningen av pre-fuktade material innan odla cellerna, eftersom detta säkerställer att cellerna får de nödvändiga näringsämnen från odlingsmediet när de är integrerade i materialet oavsett om de är på ytan eller i porerna. Slutligen är användningen av ett osteoinduktivt biomaterial kritisk för denna process eftersom det undviker tillsats av yttre faktorer för att inducera och upprätthålla osteoblastisk differentiering. Begränsningen av teknik är att den är baserad på den osteoinduktiva potentialen hos den bovina matrisen; emellertid, kan den föreslagna kultursystem extrapoleras till vilket som helst poröst material med en porfördelning av 20 till 200 um. Därför det förfarande som presenteras i detta arbete är en alternativ metod för odling av mesenkymala stamceller i olika material thatt används för vävnadsteknik, särskilt för benuppbyggnad.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner stipendium och finansiellt stöd från Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No.49887), Facultad de Medicina-UNAM DGAPA IN201510 och DGAPA IN216213; Salvador Correa av Instituto Nacional de Perinatología för hjälp med det biologiska materialet; och Biocriss, SA de C. V för att donera Nukbone. Också tacka till Ing. Héctor Martínez av IIM, UNAM och M en C Fabiola Gonzalez av CINVESTAV för tekniskt stöd.
sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
3mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
trypsin/0.5mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |