प्राथमिक सेल संस्कृति अध्ययन के लिए चिकी retinas में कुशल जीन स्थानांतरण: एक<em> पूर्व ओवो</em> Electroporation दृष्टिकोण
Summary
भ्रूण लड़की रेटिना सेल संस्कृतियों फोटोरिसेप्टर जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए मूल्यवान उपकरण का गठन। हम संस्कृति के लिए पहले रेटिना की प्लाज्मिड इलेक्ट्रोपोरेशन ओवो पूर्व के आधार पर एक कुशल जीन स्थानांतरण तकनीक विकसित की है। इस तकनीक में काफी इस प्रणाली के लिए संभव आनुवंशिक हेरफेर कर रही है, वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल पर अभिकर्मक क्षमता बढ़ जाती है।
Abstract
भ्रूण लड़की रेटिना से निकाली गई कोन फोटोरिसेप्टर समृद्ध संस्कृतियों रेटिना न्यूरॉन्स, विशेष रूप से फोटोरिसेप्टर के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए दुनिया भर के शोधकर्ताओं के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन गए हैं। वे आसानी से दवा के विकास के लिए उच्च throughput प्रौद्योगिकियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता के रूप में इस प्रणाली के आवेदन, बुनियादी अनुसंधान से परे जाना। हालांकि, इन संस्कृतियों में रेटिना फोटोरिसेप्टर की आनुवंशिक हेरफेर प्रणाली की उपयोगिता के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा में प्रस्तुत है, बहुत ही चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है। हमने हाल ही में विकसित की है और अन्य वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल 1 की तुलना में पांच गुना से इन संस्कृतियों में रेटिना की कोशिकाओं के अभिकर्मक की दर बढ़ जाती है कि प्लाज्मिड electroporation तकनीक ओवो एक पूर्व पुष्टि की है। इस विधि में भ्रूण लड़की आंखों RPE निकाल दिया जाता है, चरण 27 पर enucleated रहे हैं, और रेटिना कप एक प्लाज्मिड युक्त घोल में रखा जाता है और आसानी से निर्माण कस्टम का उपयोग कर Electroporatedबनाया इलेक्ट्रोड। रेटिना तो अलग और सुसंस्कृत मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कर रहे हैं। इस तकनीक सामान्यतः फोटोरिसेप्टर जनसंख्या का 25% में transgene अभिव्यक्ति को प्राप्त करने, प्लाज्मिड संचालित आरएनएआई प्रौद्योगिकी के उपयोग के माध्यम से उदाहरण के लिए, overexpression के अध्ययन के लिए और साथ ही जीन अभिव्यक्ति की डाउनरेगुलेशन के लिए लागू किया जा सकता है। वर्तमान प्रकाशन के वीडियो प्रारूप प्राथमिक रेटिना संस्कृतियों में जीन समारोह के अध्ययन को सक्षम, क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए इस तकनीक को आसानी से सुलभ बनाना होगा। हम यह भी एक सफल परिणाम और reproducibility के लिए इस प्रक्रिया के महत्वपूर्ण कदम की विस्तृत व्याख्या को शामिल किया है।
Introduction
भ्रूण लड़की रेटिना से अलग सेल संस्कृतियों व्यापक रूप से उनके अस्तित्व 2-9, भेदभाव 10-12, neurite परिणाम 13, और अधिक सहित फोटोरिसेप्टर कोशिका जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। रूबेन एडलर और सहयोगियों द्वारा 1980 के दशक में विकसित किया है और उसकी और अन्य समूहों 14-20, द्वारा सिद्ध इस प्रणाली का लाभ, एक पशु मॉडल 21 के रूप में लड़की के आंतरिक विशेषताओं में रहते हैं। यहां तक कि भ्रूण चरणों में लड़की आंख के बड़े आकार, संस्कृतियों के लिए सामग्री की बड़ी मात्रा में प्रदान करता है। संस्कृतियों भ्रूण दिन (ईडी) 5 का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं इसके अलावा, जब – 6 रेटिना, 55 – इस जानवर में फोटोरिसेप्टर का लगभग 86% हैं के बाद से उनके पूर्वज कोशिकाओं के 80% फोटोरिसेप्टर 14,15,18,22,23 के रूप में अंतर है, और शंकु 24, इन संस्कृतियों इस सेल प्रकार पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं।
हमने हाल ही में विकास हैped और इस प्रकार आनुवंशिक missexpression अध्ययनों एक सुविधाजनक बनाने के द्वारा इस प्रणाली की उपयोगिता को व्यापक बनाने, इन संस्कृतियों में कोशिकाओं की उच्च दक्षता प्लाज्मिड अभिकर्मक के लिए अनुमति देता है कि एक सरल तकनीक होती है। इस तकनीक के विकास के लिए एक सेल स्वायत्त तरीके में जीन समारोह के अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए अभिकर्मक का एक स्वीकार्य स्तर प्रदान करेगा कि तरीकों में से वैज्ञानिक साहित्य में एक शून्य से प्रभावित था। प्राथमिक neuronal संस्कृतियों 25,26 transfect करने के लिए बेहद मेहनत कर रहे हैं, क्योंकि इस हिस्से में है। इस उद्देश्य के लिए पहले से उपलब्ध सबसे अधिक इस्तेमाल किया तकनीकों में से कुछ 3-5% के क्रम में क्षमता में परिणाम और काफी विषाक्तता 27-32 लागू कर सकते हैं, जो इस तरह lipofection या कैल्शियम फास्फेट की मध्यस्थता अभिकर्मक के रूप में रासायनिक अभिकर्मक तरीकों, शामिल थे। एक enzymatic संवाददाता प्रणाली के साथ प्लास्मिडों के उपयोग के संकेत amplifying द्वारा गरीब अभिकर्मक दक्षता की समस्या को दरकिनार कर सकते हैं, भले ही वे नहीं करतेसेल विशिष्ट प्रभाव भेदभाव, और उनके परिणामों पूरा का प्रतिनिधि नहीं हो सकता कि एक छोटे से सेल की आबादी पर आधारित हैं। लड़की में एक और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि, RCAs वायरस के संक्रमण, proliferating कोशिकाओं के लिए ही लागू है और इस प्राथमिक रेटिना संस्कृति प्रणाली 33 के लिए इस प्रकार उपयुक्त नहीं है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में भ्रूण लड़की आंखों चरण 27 (ईडी 5), रेटिनल पिगमेंट उपकला (RPE) निकाल दिया जाता है, और रेटिना कप एक प्लाज्मिड युक्त समाधान के साथ भरा एक इलेक्ट्रोपोरेशन कक्ष में रखा गया है पर enucleated और का उपयोग कर रहे हैं electroporated कस्टम बनाया मानक तकनीक 21 का उपयोग रेटिना हदबंदी और संस्कृति के द्वारा पीछा इलेक्ट्रोड,। इस प्रक्रिया के अनुकूलन के बाद हम के अस्तित्व और भेदभाव विशेषताओं से समझौता किए बिना लगातार, संस्कृति में कोशिकाओं और अकेले फोटोरिसेप्टर आबादी के भीतर 25% की कुल संख्या का 22% के आदेश पर अभिकर्मक क्षमता हासिल करने के लिए सक्षम किया गया हैसंस्कृतियों 1। यहाँ हम इस तकनीक की सफलता और reproducibility सुनिश्चित करने के लिए इस प्रक्रिया के सभी महत्वपूर्ण कदम रूपरेखा एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम भ्रूण के उचित मंच का चयन होता है। पिछले प्रकाशनों में, भ्रूण चरणों की एक श्रृंखला के लिए आम तौर पर ऊष्मायन या भ्रूण दिनों का दिन (ईडी) द्वारा परिभाषित, इन ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge David O’Brien for his support with data analysis, and all the members of the Canto-Soler lab for their critical discussions. This work was supported by NIH grants EY004859 and EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765, and an unrestricted departmental grant from Research to Prevent Blindness, Inc.
Materials
| ECM 830 Electro Square Porator | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0115 model 512 | Gold tipped electrode used as anode |
| Polyimide Tubing | Vention Medical | custom made | Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode |
| 2.5mm square box filament, 4.5mm wide | Sutter Instrument Company | FB245B | Used to make cathode electrode |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco – Life Technologies | 14175-095 | |
| Moloney forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
| Dumont tweezers 5/45 | Roboz | RS-5058 | Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length |
| Bonn micro forceps, 1×2 teeth | Roboz | RS-5172 | Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75" Length; .3mm Tip Width |
References
- Vergara, M. N., Gutierrez, C., O’Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures. Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).
- Chalmel, F., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).
- Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture. J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).
- Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification. Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).
- Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36, 755-759 (2004).
- Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. Cone survival: identification of RdCVF. Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).
- Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).
- Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture. Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).
- Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).
- Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro. Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).
- Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).
- Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).
- Adler, R. Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor. J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).
- Adler, R. A model of retinal cell differentiation in the chick embryo. Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).
- Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
- Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures. J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).
- Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).
- Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the ‘window-labeling’ technique. Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).
- Hyndman, A. G., Adler, R. Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).
- Politi, L. E., Adler, R. Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).
- Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Dev. 7, 22 (2012).
- Adler, R. Determination of cellular types in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).
- Repka, A., Adler, R. Differentiation of retinal precursor cells born in vitro. Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).
- Morris, V. B. Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor. J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).
- Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. Transfection of rat brain cells by electroporation. J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).
- Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation. Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).
- Boatright, J. H., et al. The 5′ flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures. Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).
- Kumar, R., et al. The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures. J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).
- Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro. J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).
- Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures. J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).
- Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells. J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).
- Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).
- Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).
- Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer. J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).
- Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
- You, L. M., et al. A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells. Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
