Effektiv Gene Transfer i Chick nethinder for primær cellekultur Studies: An<em> Ex-ovo</em> Elektroporation Approach

Summary

Embryonale chick retina cellekulturer udgør værdifulde værktøjer til undersøgelse af fotoreceptor biologi. Vi har udviklet en effektiv genoverførsel teknik baseret på ex ovo plasmid elektroporation af nethinder før kulturen. Denne teknik forøger transfektionseffektiviteten i øjeblikket tilgængelige protokoller, hvilket gør genmanipulation muligt for dette system.

Abstract

Keglen fotoreceptor-berigede kulturer afledt af embryonale chick nethinder er blevet et uundværligt redskab for forskere i hele verden studerer biologi retinale neuroner, især fotoreceptorer. Anvendelserne af dette system ud over grundforskning, da de let kan tilpasses til højt gennemløb teknologier for lægemiddeludvikling. Imidlertid har genmanipulation af retinale fotoreceptorer i disse kulturer vist sig at være meget udfordrende, udgør en vigtig begrænsning for anvendeligheden af ​​systemet. Vi har for nylig udviklet og valideret en ex ovo plasmid elektroporation teknik, der øger hastigheden af transfektion af retinale celler i disse kulturer med fem gange sammenlignet med andre aktuelt tilgængelige protokoller ^1. Ved denne fremgangsmåde embryonale chick øjne er tømte i trin 27, RPE fjernes, og retinal koppen er placeret i et plasmid-indeholdende opløsning og elektroporeret under anvendelse af let konstrueres kun-lavet elektroder. Nethinder derefter dissocieres og dyrkes under anvendelse af standardprocedurer. Denne teknik kan anvendes til overekspression undersøgelser samt til nedregulering af genekspression, fx via anvendelse af plasmid-drevet RNAi teknologi, der almindeligvis opnå transgen ekspression i 25% af fotoreceptor befolkning. Den video format denne publikation vil gøre denne teknologi let tilgængelig for forskere på området, hvilket muliggør studiet af gen-funktion i primære retinale kulturer. Vi har også inkluderet detaljerede forklaringer om de kritiske trin i denne procedure for et vellykket resultat og reproducerbarhed.

Introduction

Dissocierede cellekulturer fra embryonale chick nethinder er ofte blevet brugt til at studere forskellige aspekter af fotoreceptorer cellebiologi, herunder deres overlevelse ^2-9, differentiering ^10-12, neuritvækst ^13, og meget mere. Fordelene ved dette system, der er udviklet i 1980'erne af Ruben Adler og samarbejdspartnere og perfektioneret af hans og andre grupper ^14-20, bor i de iboende egenskaber chick som en dyremodel ^21. Den store størrelse af chick øjet, selv ved fosterstadiet, giver store mængder materiale for kulturer. Desuden, når kulturer udføres ved anvendelse af embryonale dag (ED) 5 – 6 nethinder, 55 – 80% af deres progenitor celler differentierer som fotoreceptorer ^{14,15,18,22,23,} og da ca. 86% af fotoreceptorerne i dette dyr er kegler ^24, disse kulturer er særligt egnede til undersøgelser, der fokuserer på denne celletype.

Vi har for nylig udvikPED og karakteriseret en simpel teknik, som muliggør højeffektiv plasmid transfektion af cellerne i disse kulturer, og dermed udvide anvendeligheden af dette system ved at lette genetisk missexpression undersøgelser ^1. Udviklingen af ​​denne teknik stammede fra et tomrum i den videnskabelige litteratur af metoder, der vil tilvejebringe et acceptabelt niveau for transfektion at muliggøre undersøgelse af genfunktion i en celle uafhængig måde. Dette skyldes delvist, at primære neuronale kulturer er notorisk svære at transficere ^25,26. Nogle af de mest almindeligt anvendte teknikker tidligere tilgængelige til dette formål inkluderet kemiske transfektionsfremgangsmåder såsom lipofektion eller calciumphosphat-medieret transfektion, der resulterer i effektiviteter i størrelsesordenen 3-5% og kan være en betydelig toksicitet ^27-32. Selv om anvendelsen af ​​plasmider med en enzymatisk reporter systemet kan omgå problemet med ringe transfektionseffektivitet ved at forstærke signalet, ikke dediskriminere celle-specifikke effekter, og deres resultater er baseret på en lille celle befolkning, der måske ikke er repræsentative for hele. En anden meget anvendt metode i chick, RCAS virusinfektion, er kun for prolifererende celler og dermed ikke egnet til dette primære retinal kultur-system ^33.

I den nuværende protokol embryoniske kyllinge øjne er tømte i trin 27 (ED 5), det retinale pigmenterede epithelium (RPE) fjernes, og retinal koppen er placeret i et elektroporation kammer fyldt med et plasmid-indeholdende opløsning og elektroporeret under anvendelse af specialfremstillet elektroder, efterfulgt af retinal dissociation og kultur under anvendelse af standardteknikker ^21. Efter optimering denne procedure har vi været i stand til konsekvent at opnå transfektionseffektiviteten af ​​størrelsesordenen 22% af det samlede antal celler i kultur og 25% i fotoreceptor befolkningen alene, uden at det går overlevelse og differentiering egenskaberkulturer ^1. Her giver vi en detaljeret protokol beskriver alle de vigtige trin i denne procedure for at sikre succes og reproducerbarheden af ​​denne teknik.

Protocol

Alle procedurer, der er beskrevet i dette arbejde blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der anbefales af Animal Care og brug Udvalg på Johns Hopkins University. 1. Forud for tid: Udarbejdelse af Instrumenter, reagenser og fade Fremstilling af æg: Inkuber befrugtede White Leghorn hønseæg ved 37,5 ° C og 60% relativ fugtighed i 5 dage i et æg inkubator. BEMÆRK: En inkubator med rokkende kapacitet kan være nyttige for standardisering og synkronisering …

Representative Results

Her præsenterer vi en enkel protokol til plasmidtransfektion ind tømte chick retinale pokaler til efterfølgende dissocieret cellekultur. Transfektion opnås ved elektroporering under anvendelse af let at gøre brugerdefinerede elektroder (figur 1 – 2). De i denne protokol beskrevne parametre er blevet optimeret for at opnå transfektionseffektiviteten der spænder mellem 20 og 27% (med et gennemsnit på 22%) (figur 3D). Bemærk, at for de ovenfor anførte grunde, er disse resultater …

Discussion

Den mest kritiske skridt for succes i denne protokol er at vælge den rette fase af embryoner. I tidligere udgivelser, er en række embryonale stadier givet for disse kulturer, typisk defineret af dages inkubation eller embryonale dage (ED); dermed er det normalt antages, at bruge ED 5 til ED 6 embryoner vil give tilsvarende resultater. Men vi har fundet, at på scenen 27 (ED 5), vil transfektionseffektivitet være omkring 22% af den totale cellepopulation, som anført ovenfor; endnu effektivitet vil falde til 16%, hvis…

Materials

ECM 830 Electro Square Porator	BTX/ Harvard Apparatus	45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip	BTX/ Harvard Apparatus	45-0115 model 512	Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing	Vention Medical	custom made	Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5mm square box filament, 4.5mm wide	Sutter Instrument Company	FB245B	Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco – Life Technologies	14175-095
Moloney forceps	Roboz	RS-8254	Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45	Roboz	RS-5058	Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1×2 teeth	Roboz	RS-5172	Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75" Length; .3mm Tip Width