Efficient Gene Transfer dans Chick rétines pour cellulaires primaires études sur la culture: Un<em> Ex-ovo</em> Approche d'électroporation

Summary

Cultures embryonnaires de cellules rétiniennes chiches constituent des outils précieux pour l'étude de la biologie photorécepteur. Nous avons mis au point une technique de transfert de gène efficace sur la base de plasmide électroporation ex ovo de la rétine antérieure à la culture. Cette technique augmente considérablement les efficacités de transfection sur des protocoles actuellement disponibles, ce qui rend possible une manipulation génétique pour ce système.

Abstract

Les cultures photoréceptrices enrichi cône provenant de rétines chiches embryonnaires sont devenus un outil indispensable pour les chercheurs du monde entier qui étudient la biologie des neurones de la rétine, en particulier les photorécepteurs. Les applications de ce système vont au-delà de la recherche fondamentale, car ils peuvent facilement être adaptés aux technologies à haut débit pour le développement de médicaments. Toutefois, la manipulation génétique des photorécepteurs de la rétine dans ces cultures est avérée très difficile, ce qui constitue une limitation importante de l'utilité du système. Nous avons récemment développé et validé un plasmide ex ovo technique d'électroporation qui augmente le taux de transfection de cellules de la rétine dans ces cultures par cinq fois par rapport à d'autres protocoles actuellement disponibles ^1. Dans cette méthode yeux chiches embryonnaires sont énucléés à l'étape 27, l'EPR est enlevée, et la coupe de la rétine est placé dans une solution contenant le plasmide et électroporation utilisant CUSTOM- facilement construitsélectrodes faites. Les rétines sont ensuite dissociés et cultivées en utilisant des procédures standard. Cette technique peut être appliquée à des études de surexpression, ainsi que la régulation négative de l'expression génique, par exemple via l'utilisation de la technologie d'ARNi induite par le plasmide, la réalisation couramment l'expression du transgène dans 25% de la population ayant une photorécepteur. Le format vidéo de la présente publication rendre cette technologie facilement accessible aux chercheurs dans le domaine, ce qui permet l'étude de la fonction des gènes dans les cultures primaires rétiniennes. Nous avons également inclus des explications détaillées sur les étapes essentielles de cette procédure pour le succès et la reproductibilité.

Introduction

Des cultures de cellules dissociées à partir de rétines embryonnaires de poulet ont été largement utilisés pour étudier les différents aspects de la biologie des cellules de photorécepteur, y compris leur survie ^{09/02, 12/10} différenciation, la croissance des neurites ^13, et plus encore. Les avantages de ce système, mis au point dans les années 1980 par Ruben Adler et collaborateurs et perfectionné par ses et d'autres groupes ^14-20, résident dans les caractéristiques intrinsèques de la nana comme un modèle animal ^21. La grande taille de l'œil de poulet, même à des stades embryonnaires, fournit de grandes quantités de matériel pour les cultures. En outre, lorsque les cultures sont réalisées en utilisant jour embryonnaire (ED) 5 – 6 rétines, de 55 à 80% de leurs cellules progénitrices différencier en photorécepteurs ^{14,15,18,22,23,} et puisque environ 86% des photorécepteurs de cet animal sont cônes ^24, ces cultures sont particulièrement adaptés pour les études portant sur ​​ce type de cellule.

Nous avons récemment déveped et caractérisé une technique simple qui permet à haut rendement plasmide transfection des cellules dans ces cultures, élargissant ainsi l'utilité de ce système en facilitant les études de génétique missexpression ^1. Le développement de cette technique découle d'un vide dans la littérature scientifique des méthodes qui permettraient un niveau acceptable de transfection pour permettre l'étude de la fonction des gènes d'une manière autonome cellulaire. Ceci est en partie à cause des cultures de neurones primaires sont notoirement difficiles à transfecter ^25,26. Certaines des techniques les plus couramment utilisées précédemment disponibles à cet effet inclus méthodes de transfection chimiques tels que la lipofection ou phosphate de calcium, transfection qui se traduisent par des rendements de l'ordre de 3-5% et peuvent exercer une toxicité considérable ^27-32. Même si l'utilisation de plasmides avec un système rapporteur enzymatique peut contourner le problème de la mauvaise efficacité de la transfection par l'amplification du signal, ils ne le font pasdiscriminer les effets spécifiques des cellules, et leurs résultats sont basés sur une petite population de cellules qui peuvent ne pas être représentative de l'ensemble. Une autre méthode largement utilisée dans le poussin, infection par le virus RCAS, est applicable uniquement aux cellules proliférantes et ne conviennent donc pas pour cette primaire système de culture de la rétine ^33.

Dans le protocole actuel yeux chiches embryonnaires sont énucléés à l'étape 27 (ED 5), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est enlevée, et la coupe de la rétine est placé dans une chambre d'électroporation rempli d'une solution contenant le plasmide et électroporation en utilisant sur mesure des électrodes, suivie de dissociation de la rétine et de la culture en utilisant des techniques standards ^21. Après l'optimisation de cette procédure, nous avons été en mesure de réaliser systématiquement des efficacités de transfection de l'ordre de 22% du nombre total de cellules en culture et 25% au sein de la population de photorécepteur seul, sans compromettre les caractéristiques de survie et la différenciation descultures ^1. Ici, nous fournissons un protocole détaillé décrivant toutes les étapes importantes de cette procédure afin d'assurer le succès et la reproductibilité de cette technique.

Protocol

Toutes les procédures décrites dans cet ouvrage ont été réalisés selon les directives recommandées par la protection des animaux et l'utilisation Comité à l'Université Johns Hopkins. 1. Ahead of Time: préparation d'instruments, réactifs et Plats Préparation des oeufs: incuber des oeufs fertilisés de poulet White Leghorn à 37,5 ° C et 60% d'humidité relative pendant 5 jours dans un incubateur d'œufs. REMARQUE: Un incubateur avec des rock…

Representative Results

Nous présentons ici un protocole simple pour le plasmide transfection dans énucléés chiches tasses rétiniennes pour la culture cellulaire dissociée ultérieure. La transfection est réalisée par électroporation en utilisant facile à faire personnalisés électrodes (Figures 1 – 2). Les paramètres décrits dans ce protocole ont été optimisés pour obtenir des efficacités de transfection qui se situent entre 20 et 27% (avec une moyenne de 22%) (Figure 3D). No…

Discussion

L'étape la plus critique pour le succès de ce protocole est de sélectionner le stade approprié des embryons. Dans les publications précédentes, une série de stades embryonnaires est donnée pour ces cultures, généralement définie par les jours d'incubation ou embryonnaires jours (ED); donc il est généralement supposé que l'utilisation ED ED 5 à 6 embryons donnera des résultats équivalents. Cependant, nous avons constaté que sur scène 27 (ED 5), l'efficacité de transfection sera autour …

Materials

ECM 830 Electro Square Porator	BTX/ Harvard Apparatus	45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip	BTX/ Harvard Apparatus	45-0115 model 512	Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing	Vention Medical	custom made	Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5mm square box filament, 4.5mm wide	Sutter Instrument Company	FB245B	Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco – Life Technologies	14175-095
Moloney forceps	Roboz	RS-8254	Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45	Roboz	RS-5058	Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1×2 teeth	Roboz	RS-5172	Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75" Length; .3mm Tip Width