העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em> אקס-אוב</em> גישת Electroporation
Summary
תרביות תאים עובריים חומוס רשתית מהוות כלים חשובים למחקר של ביולוגיה קולטי האור. פיתחנו טכניקת העברה יעילה של גנים המבוססת על לשעבר אוב electroporation פלסמיד של הרשתית לפני התרבות. טכניקה זו במידה ניכרת מגבירה את יעילות transfection על פרוטוקולים זמינים כרגע, מה שהופך את המניפולציה גנטית אפשרית למערכת זו.
Abstract
התרבויות מועשרות קולטי האור קונוס נגזרות מרשתית חומוס עוברית הפכו לכלי הכרחי עבור חוקרים ברחבי העולם לומדים את הביולוגיה של תאי עצב ברשתית, במיוחד קולטני אור. היישומים של מערכת זו ללכת מעבר למחקר בסיסי, כפי שהם יכולים בקלות להיות מותאמים לטכנולוגיות תפוקה גבוהות לפיתוח תרופות. עם זאת, מניפולציה גנטית של קולטני האור ברשתית בתרבויות אלה הוכיחה להיות מאוד מאתגרים, שהתחזה הגבלה חשובה התועלת של המערכת. פיתחנו לאחרונה ומאומתים לשעבר אוב טכניקת electroporation פלסמיד שמגבירה את קצב transfection של תאי רשתית בתרבויות אלה על ידי פי חמש בהשוואה לפרוטוקולים זמינים כעת אחרים 1. בשיטה זו enucleated עיני חומוס עוברי בשלב 27, הרשתית מוסרת, וכוס הרשתית ממוקמת בפתרון המכיל פלסמיד וElectroporated באמצעות מנהג נבנה בקלותאלקטרודות עשויות. אז הרשתית הם ניתקו ותרבותיים באמצעות נהלים סטנדרטיים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרי ביטוי יתר כמו גם לdownregulation של ביטוי גנים, למשל באמצעות השימוש בטכנולוגית RNAi מונע פלסמיד, בדרך כלל השגת ביטוי transgene ב -25% מאוכלוסיית קולטי האור. הווידאו בפורמט של הפרסום הנוכחי יהפוך את הטכנולוגיה הזו בקלות נגישה לחוקרים בתחום, המאפשר חקר תפקוד גן בתרבויות רשתית עיקריות. גם יש לנו כלל הסברים מפורטים של השלבים הקריטיים של הליך זה לתוצאה ושחזור מוצלח.
Introduction
תרביות תאים ניתקות מרשתית חומוס העוברית היו בשימוש נרחב ללמוד היבטים שונים של ביולוגיה של תא קולטי האור, כולל ההישרדות שלהם 2-9, בידול 10-12, תולדת neurite 13, ועוד. היתרונות של מערכת זו, שפותחו בשנת 1980 על ידי ראובן אדלר ומשתפי פעולה ושוכללו על ידי הקבוצות האחרות שלו ו14-20, מתגוררים במאפיינים הפנימיים של החומוס כמודל חיה 21. הגודל הגדול של העין החומוס, אפילו בשלבים עובריים, מספק כמויות גדולות של חומר לתרבויות. יתר על כן, כאשר תרבויות מבוצעות באמצעות יום עוברי (ED) 5 – 6 רשתית, 55 – 80% מהתאים שלהם להבחין בקולטני אור 14,15,18,22,23, ומאז כ 86% מהקולטניים האור בבעלי חיים זה הם קונוסים 24, תרבויות אלה מתאימים במיוחד למחקרים המתמקדים בסוג תא זה.
יש לנו לאחרונה developed ומתאפיין בטכניקה פשוטה שמאפשרת לtransfection פלסמיד יעילות גבוהה של התאים בתרבויות אלה, ובכך להרחיב את השימושיות של מערכת זו על ידי הקלת מחקרים הגנטי missexpression 1. הפיתוח של טכניקה זו נבע מחלל בשיטות שיספקו רמה מקובלת של transfection כדי לאפשר לחקר תפקוד הגן באופן אוטונומי תא הספרות המדעית. זה בין שאר משום שתרבויות עצביות עיקריות הן ידוע לשמצה קשה transfect 25,26. כמה הטכניקות הנפוצות ביותר הזמינות בעבר למטרה זו כללו שיטות כימיות transfection כגון transfection תיווך פוספט lipofection או סידן, אשר תוצאת היעילות בצו של 3-5% ויכולים להפעיל רעילות ניכרת 27-32. למרות שהשימוש בפלסמידים עם מערכת כתב האנזימטית יכולים לעקוף את הבעיה של יעילות transfection עניה על ידי הגברת האות, הם לאלהפלות השפעות תא ספציפי, והתוצאות שלהם מבוססות על אוכלוסיית תאים קטנה שלא יכול להיות נציג של כל. שיטה נפוצה נוספת בחומוס, זיהום בנגיף RCAS, חל רק על תאים מתרבים ולכן לא מתאימה למערכת זו עיקרי רשתית התרבות 33.
בפרוטוקול הנוכחי enucleated עיני חומוס עוברי בשלב 27 (ED 5), האפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוסר, וכוס הרשתית ממוקמת בתא electroporation המלא עם פתרון המכיל פלסמיד וelectroporated באמצעות מחוייט אלקטרודות, ואחרי ניתוק רשתית ותרבות תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית 21. לאחר אופטימיזציה הליך זה הצלחנו להשיג יעילות transfection באופן עקבי על מנת של 22% מהמספר הכולל של תאים בתרבית ו -25% בקרב אוכלוסיית קולטי האור לבד, מבלי להתפשר על מאפייני הישרדות ובידול שלתרבויות 1. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט המתאר את כל השלבים החשובים של הליך זה על מנת להבטיח את הצלחת ושחזור של טכניקה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלב הקריטי ביותר להצלחה של פרוטוקול זה הוא בחירת השלב המתאים של העוברים. בפרסומים קודמים, מגוון של שלבים עובריים ניתן לתרבויות אלה, מוגדרים בדרך כלל על ידי הימים של ימי דגירה או עוברי (ED); כך זה בדרך כלל להניח כי השימוש בED 5 לED 6 עוברים יניבו תוצאות שווה ערך. עם זאת מצאנו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge David O’Brien for his support with data analysis, and all the members of the Canto-Soler lab for their critical discussions. This work was supported by NIH grants EY004859 and EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765, and an unrestricted departmental grant from Research to Prevent Blindness, Inc.
Materials
| ECM 830 Electro Square Porator | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0115 model 512 | Gold tipped electrode used as anode |
| Polyimide Tubing | Vention Medical | custom made | Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode |
| 2.5mm square box filament, 4.5mm wide | Sutter Instrument Company | FB245B | Used to make cathode electrode |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco – Life Technologies | 14175-095 | |
| Moloney forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
| Dumont tweezers 5/45 | Roboz | RS-5058 | Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length |
| Bonn micro forceps, 1×2 teeth | Roboz | RS-5172 | Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75" Length; .3mm Tip Width |
References
- Vergara, M. N., Gutierrez, C., O’Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures. Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).
- Chalmel, F., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).
- Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture. J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).
- Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification. Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).
- Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36, 755-759 (2004).
- Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. Cone survival: identification of RdCVF. Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).
- Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).
- Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture. Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).
- Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).
- Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro. Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).
- Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).
- Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).
- Adler, R. Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor. J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).
- Adler, R. A model of retinal cell differentiation in the chick embryo. Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).
- Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
- Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures. J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).
- Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).
- Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the ‘window-labeling’ technique. Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).
- Hyndman, A. G., Adler, R. Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).
- Politi, L. E., Adler, R. Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).
- Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Dev. 7, 22 (2012).
- Adler, R. Determination of cellular types in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).
- Repka, A., Adler, R. Differentiation of retinal precursor cells born in vitro. Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).
- Morris, V. B. Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor. J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).
- Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. Transfection of rat brain cells by electroporation. J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).
- Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation. Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).
- Boatright, J. H., et al. The 5′ flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures. Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).
- Kumar, R., et al. The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures. J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).
- Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro. J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).
- Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures. J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).
- Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells. J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).
- Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).
- Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).
- Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer. J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).
- Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
- You, L. M., et al. A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells. Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
