Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An<em> Ex-ovo</em> Eletroporação Approach

Summary

Culturas de células da retina pintinho embrionárias constituem ferramentas importantes para o estudo da biologia de fotorreceptores. Nós desenvolvemos uma técnica de transferência de gene eficiente com base em ex ovo plasmídeo electroporação das retinas antes da cultura. Esta técnica aumenta consideravelmente a eficiência de transfecção através de protocolos disponíveis atualmente, fazendo a manipulação genética viável para este sistema.

Abstract

As culturas enriquecidas com cone fotorreceptoras da retina derivadas de bico embrionárias tornaram-se uma ferramenta indispensável para pesquisadores de todo o mundo que estudam a biologia dos neurônios da retina, particularmente fotorreceptores. As aplicações deste sistema excede investigação fundamental, uma vez que podem ser facilmente adaptados às tecnologias de elevado rendimento para o desenvolvimento de drogas. No entanto, a manipulação genética de fotorreceptores da retina nestas culturas tem provado ser muito desafiador, que levanta uma importante limitação para a utilidade do sistema. Temos recentemente desenvolvido e validado um ex ovo técnica de electroporação plasmídeo que aumenta a taxa de transfecção de células de retina nestas culturas por cinco vezes em comparação com outros protocolos actualmente disponíveis ^1. Neste método pinto embrionário olhos são enucleados no estágio 27, o RPE é removido, ea taça da retina é colocado em uma solução contendo plasmídeo e electroporado usando custom- facilmente construídosfeitos eléctrodos. As retinas são então dissociados e cultivadas utilizando procedimentos padrão. Esta técnica pode ser aplicada a estudos sobre-expressão, bem como para a regulação negativa da expressão do gene, por exemplo, através da utilização de tecnologia RNAi-driven plasmídeo, geralmente atingir a expressão do transgene em 25% da população de fotorreceptores. O formato de vídeo da presente publicação irá tornar esta tecnologia de fácil acesso para os pesquisadores da área, permitindo o estudo da função dos genes em culturas de retina primários. Incluímos também explicações detalhadas sobre as etapas críticas de este procedimento para um resultado de sucesso e reprodutibilidade.

Introduction

Culturas de células dissociadas de retinas de pintainho embrionário têm sido amplamente utilizados para o estudo de vários aspectos da biologia celular de fotorreceptores, incluindo a sua sobrevivência ^{2-9, 10-12} diferenciação, crescimento de neuritos ^13, e mais. As vantagens deste sistema, desenvolvido na década de 1980 por Ruben Adler e colaboradores e aperfeiçoados por suas e de outros grupos ^14-20, residem nas características intrínsecas do pinto como um modelo animal ^21. O grande tamanho do olho do pintainho, mesmo em estádios embrionários, fornece grandes quantidades de material para culturas. Além disso, quando as culturas são realizadas utilizando dia embrionário (ED) 5 – 6 retinas, 55 – 80% das suas células progenitoras diferenciam como fotorreceptores ^{14,15,18,22,23,} e desde cerca de 86% dos fotorreceptores nesse animal são ²⁴ cones, estas culturas são particularmente adequados para estudos que focalizam o tipo de célula.

Temos recentemente desenPED e caracterizada uma técnica simples que permite um processo de alta eficiência de transfecção de plasmídeo das células nestas culturas, alargando assim a utilidade deste sistema, facilitando estudos missexpression genética ^1. O desenvolvimento desta técnica resultou de um vazio na literatura científica de métodos que proporcionem um nível aceitável de transfecção para permitir o estudo da função dos genes de uma maneira autónoma da célula. Isto é em parte porque as culturas primárias neuronais são notoriamente difíceis de transfectar ^25,26. Algumas das técnicas mais comumente usadas anteriormente disponíveis para o efeito métodos de transfecção incluiu químicos, tais como lipofecção ou cálcio transfecção mediada por fosfato, que resultam em eficácia na ordem de 3-5% e pode exercer toxicidade considerável ^27-32. Embora a utilização de plasmídeos com um sistema de repórter enzimático pode contornar o problema da falta de eficiência de transfecção por amplificação do sinal, eles não fazemdiscriminar efeitos específicos de células, e os seus resultados são baseados em uma população de células pequenas que podem não ser representativas do conjunto. Outro método amplamente utilizado na pintinho, infecção por vírus RCAS, só é aplicável a células em proliferação e, portanto, não é adequado para este sistema de cultura de retina primário ^33.

No protocolo de corrente pintainho embrionário olhos são enucleados na fase 27 (ED 5), o epitélio pigmentado da retina (RPE) é removido, e o copo da retina é colocado numa câmara de electroporação preenchido com uma solução contendo o plasmídeo e electroporadas utilizando feito por encomenda eléctrodos, seguido pela dissociação da retina e de cultura usando técnicas convencionais. ²¹ Depois de optimizar este procedimento, temos sido capazes de conseguir de forma consistente eficiências de transfecção na ordem de 22% do número total de células em cultura e de 25% na população de fotorreceptores por si só, sem comprometer as características de sobrevivência e diferenciação de aculturas ^1. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado descrevendo todas as etapas importantes deste processo, a fim de garantir o sucesso e reprodutibilidade desta técnica.

Protocol

Todos os procedimentos descritos neste trabalho foram realizadas de acordo com as orientações recomendadas pelo Animal Care e do Comitê Use da Universidade Johns Hopkins. 1. Ahead of Time: preparação de instrumentos, reagentes e pratos Preparação de Ovos: ovos de galinha fertilizados Incubar Leghorn branco a 37,5 ° C e 60% de humidade relativa durante 5 dias numa incubadora de ovos. NOTA: Uma incubadora com capacidade de balanço pode ser útil para padronizar e sin…

Representative Results

Aqui apresentamos um protocolo simples para o plasmídeo transfecção em copos de bico da retina enucleados para posterior cultura de células dissociadas. Transfecção é obtida por eletroporação usando fácil de fazer eletrodos personalizados (Figuras 1 – 2). Os parâmetros descritos neste protocolo foram otimizados para obter eficiências de transfecção que variam entre 20 e 27% (com uma média de 22%) (Figura 3D). Note-se que, pelas razões acima expostas, est…

Discussion

O passo mais crítico para o sucesso deste protocolo é a selecção do estágio apropriado dos embriões. Em publicações anteriores, uma série de estágios embrionários é dada para estas culturas, tipicamente, definida pelos dias de incubação ou embrionárias dias (ED); portanto, é geralmente assumido que a utilização de ED de 5 a 6 ED embriões irá produzir resultados equivalentes. No entanto verificou-se que na fase 27 (ED 5), a eficiência de transfecção será de cerca de 22% da população total de cé…

Materials

ECM 830 Electro Square Porator	BTX/ Harvard Apparatus	45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip	BTX/ Harvard Apparatus	45-0115 model 512	Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing	Vention Medical	custom made	Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5mm square box filament, 4.5mm wide	Sutter Instrument Company	FB245B	Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco – Life Technologies	14175-095
Moloney forceps	Roboz	RS-8254	Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45	Roboz	RS-5058	Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1×2 teeth	Roboz	RS-5172	Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75" Length; .3mm Tip Width