Effektiv Gene Transfer i Chick näthinnor för Primär cellkulturstudier: En<em> Ex-ovo</em> Elektroporation Tillvägagångssätt

Summary

Embryonala chick retinala cellkulturer utgör värdefulla verktyg för studier av fotoreceptor biologi. Vi har utvecklat en effektiv genöverföring teknik baserad på ex ovo plasmid elektroporering av näthinnor före kultur. Denna teknik ökar avsevärt transfektionseffektivitet jämfört med för närvarande tillgängliga protokoll, vilket gör genmanipulation möjligt för detta system.

Abstract

De kon fotoreceptorberikade odlingar härrör från embryonala chick näthinnor har blivit ett oumbärligt verktyg för forskare runt om i världen studerar biologi näthinnans nervceller, särskilt fotoreceptorer. Tillämpningar av detta system utöver grundforskning, eftersom de lätt kan anpassas till hög kapacitet teknik för läkemedelsutveckling. Dock har genetisk manipulation av retinala fotoreceptorer i dessa kulturer visat sig vara mycket utmanande, utgör en viktig begränsning av systemets användbarhet. Vi har nyligen utvecklat och validerat en ex ovo plasmid elektroporering teknik som ökar hastigheten för transfektion av retinala celler i dessa kulturer med femfaldigt jämfört med andra närvarande tillgängliga protokoll ^1. I denna metod embryonala chick ögon är enucleated vid steget 27, RPE avlägsnas och näthinnans koppen placeras i en plasmid-innehållande lösning och elektro användning konstrueras enkelt kun-gjorda elektroder. Näthinnor därefter dissocieras och odlas med användning av standardförfaranden. Denna teknik kan tillämpas på överuttryck studier samt till nedreglering av genexpression, t ex via användning av plasmid-driven RNAi-tekniken, som vanligen uppnås transgen expression i 25% av fotoreceptorpopulationen. Videoformat i denna broschyr kommer att göra denna teknik lättillgängliga för forskare inom området, vilket möjliggör studier av geners funktion i primära retinala kulturer. Vi har även inkluderat detaljerade förklaringar av de kritiska stegen i detta förfarande för ett lyckat resultat och reproducerbarhet.

Introduction

Dissocierade cellkulturer från embryonala chick näthinnor har använts i stor utsträckning för att studera olika aspekter av fotoreceptor cellbiologi, inklusive deras överlevnad ^2-9, differentiering ^10-12, neuritutväxt ^13, och mer. Fördelarna med detta system, som utvecklats på 1980-talet av Ruben Adler och medarbetare och fulländade av hans och andra grupper ^14-20, bor i de inneboende egenskaperna hos ungen som en djurmodell ^21. Den stora storleken på ungen ögat, även vid embryonala stadier, ger stora mängder material för kulturer. Dessutom, när odlingarna utfördes med användning av embryonala dag (ED) 5 – 6 näthinnor, 55 – 80% av deras ursprungsceller differentierar som fotoreceptorer ^{14,15,18,22,23,} och eftersom cirka 86% av fotoreceptorer i detta djur är ^konerna 24, dessa kulturer är särskilt lämpliga för studier som fokuserar på denna celltyp.

Vi har nyligen utveckped och kännetecknas en enkel teknik som gör det möjligt för högeffektiv plasmidtransfektion av celler i dessa kulturer, vilket bredda användbarheten av detta system genom att underlätta genetisk missexpression studier ^1. Utvecklingen av denna teknik härrörde från ett tomrum i den vetenskapliga litteraturen av metoder som skulle tillhandahålla en acceptabel nivå av transfektion för att medge studier av genfunktion i en cell självständigt sätt. Detta beror delvis på att primära neuronala kulturer är notoriskt svåra att transfektera ^25,26. Några av de mest använda teknikerna tidigare tillgängliga för detta ändamål ingår kemiska transfektion metoder såsom lipofektion eller kalciumfosfat-medierad transfektion, vilket resulterar i effektivitetsvinster i storleksordningen 3-5% och kan utöva betydande toxicitet ^27-32. Även om användning av plasmider med en enzymatisk reportersystem kan kringgå problemet med dålig transfektionseffektivitet genom att förstärka signalen, de intediskriminera cellspecifika effekter, och resultaten baseras på en liten cellpopulation som kanske inte är representativa för hela. En annan allmänt använd metod i chick, RCAS virusinfektion, är endast tillämplig på prolifererande celler och därmed inte lämpar sig för detta primära retinal odlingssystem ^33.

I det nuvarande protokollet embryonala chick ögon är enucleated i steg 27 (ED 5), det retinala pigmenterade epitel (RPE) avlägsnas, och det retinala koppen placeras i en elektroporation kammare fylld med en plasmid innehållande lösning och elektro använder skräddarsydda elektroder, följt av retinal dissociation och kultur med hjälp av standardtekniker ^21. Efter att optimera detta förfarande har vi kunnat uppnå genomgående transfektion effektivitet i storleksordningen 22% av det totala antalet celler i odling och 25% inom ensam ljusmätare befolkningen, utan att kompromissa med överlevnad och differentiering egenskaperkulturer ^1. Här ger vi ett detaljerat protokoll beskriver alla viktiga steg i detta förfarande för att säkerställa framgång och reproducerbarhet av denna teknik.

Protocol

Alla procedurer som beskrivs i detta arbete genomfördes i enlighet med de riktlinjer som rekommenderas av Animal Care och användning kommittén vid Johns Hopkins University. 1. Inför Tid: Beredning av instrument, reagens och Rätter Framställning av ägg: Inkubera befruktade Vit Leghorn hönsägg vid 37,5 ° C och 60% relativ fuktighet under 5 dagar i ett ägg inkubator. OBS: En inkubator med gungande kapacitet kan vara till hjälp för att standardisera och synkroniser…

Representative Results

Här presenterar vi ett enkelt protokoll för plasmidtransfektion i enukleerat chick retinal koppar för efterföljande dissocierade cellkultur. Transfektion åstadkoms genom elektroporering med användning av lätt att göra anpassade elektroder (fig 1 – 2). De parametrar som beskrivs i detta protokoll har optimerats för att få transfektion effektivitetsvinster som sträcker sig mellan 20 och 27% (med ett genomsnitt på 22%) (Figur 3D). Lägg märke till att för de skäl som anges o…

Discussion

Det mest kritiska steget för att lyckas med detta protokoll är att välja rätt skede av embryon. I tidigare publikationer är en rad av de embryonala stadierna ges för dessa kulturer, vanligtvis definieras av dagars inkubation eller embryonala dagar (ED); därför är det vanligtvis antas att användning av ED 5 till ED 6 embryon kommer att ge likvärdiga resultat. Vi har emellertid funnit att på scenen 27 (ED 5), kommer transfektionseffektiviteten vara runt 22% av den totala cellpopulationen, som nämnts ovan; men…

Materials

ECM 830 Electro Square Porator	BTX/ Harvard Apparatus	45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip	BTX/ Harvard Apparatus	45-0115 model 512	Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing	Vention Medical	custom made	Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5mm square box filament, 4.5mm wide	Sutter Instrument Company	FB245B	Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco – Life Technologies	14175-095
Moloney forceps	Roboz	RS-8254	Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45	Roboz	RS-5058	Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1×2 teeth	Roboz	RS-5172	Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75" Length; .3mm Tip Width