Embryonala chick retinala cellkulturer utgör värdefulla verktyg för studier av fotoreceptor biologi. Vi har utvecklat en effektiv genöverföring teknik baserad på ex ovo plasmid elektroporering av näthinnor före kultur. Denna teknik ökar avsevärt transfektionseffektivitet jämfört med för närvarande tillgängliga protokoll, vilket gör genmanipulation möjligt för detta system.
De kon fotoreceptorberikade odlingar härrör från embryonala chick näthinnor har blivit ett oumbärligt verktyg för forskare runt om i världen studerar biologi näthinnans nervceller, särskilt fotoreceptorer. Tillämpningar av detta system utöver grundforskning, eftersom de lätt kan anpassas till hög kapacitet teknik för läkemedelsutveckling. Dock har genetisk manipulation av retinala fotoreceptorer i dessa kulturer visat sig vara mycket utmanande, utgör en viktig begränsning av systemets användbarhet. Vi har nyligen utvecklat och validerat en ex ovo plasmid elektroporering teknik som ökar hastigheten för transfektion av retinala celler i dessa kulturer med femfaldigt jämfört med andra närvarande tillgängliga protokoll 1. I denna metod embryonala chick ögon är enucleated vid steget 27, RPE avlägsnas och näthinnans koppen placeras i en plasmid-innehållande lösning och elektro användning konstrueras enkelt kun-gjorda elektroder. Näthinnor därefter dissocieras och odlas med användning av standardförfaranden. Denna teknik kan tillämpas på överuttryck studier samt till nedreglering av genexpression, t ex via användning av plasmid-driven RNAi-tekniken, som vanligen uppnås transgen expression i 25% av fotoreceptorpopulationen. Videoformat i denna broschyr kommer att göra denna teknik lättillgängliga för forskare inom området, vilket möjliggör studier av geners funktion i primära retinala kulturer. Vi har även inkluderat detaljerade förklaringar av de kritiska stegen i detta förfarande för ett lyckat resultat och reproducerbarhet.
Dissocierade cellkulturer från embryonala chick näthinnor har använts i stor utsträckning för att studera olika aspekter av fotoreceptor cellbiologi, inklusive deras överlevnad 2-9, differentiering 10-12, neuritutväxt 13, och mer. Fördelarna med detta system, som utvecklats på 1980-talet av Ruben Adler och medarbetare och fulländade av hans och andra grupper 14-20, bor i de inneboende egenskaperna hos ungen som en djurmodell 21. Den stora storleken på ungen ögat, även vid embryonala stadier, ger stora mängder material för kulturer. Dessutom, när odlingarna utfördes med användning av embryonala dag (ED) 5 – 6 näthinnor, 55 – 80% av deras ursprungsceller differentierar som fotoreceptorer 14,15,18,22,23, och eftersom cirka 86% av fotoreceptorer i detta djur är konerna 24, dessa kulturer är särskilt lämpliga för studier som fokuserar på denna celltyp.
Vi har nyligen utveckped och kännetecknas en enkel teknik som gör det möjligt för högeffektiv plasmidtransfektion av celler i dessa kulturer, vilket bredda användbarheten av detta system genom att underlätta genetisk missexpression studier 1. Utvecklingen av denna teknik härrörde från ett tomrum i den vetenskapliga litteraturen av metoder som skulle tillhandahålla en acceptabel nivå av transfektion för att medge studier av genfunktion i en cell självständigt sätt. Detta beror delvis på att primära neuronala kulturer är notoriskt svåra att transfektera 25,26. Några av de mest använda teknikerna tidigare tillgängliga för detta ändamål ingår kemiska transfektion metoder såsom lipofektion eller kalciumfosfat-medierad transfektion, vilket resulterar i effektivitetsvinster i storleksordningen 3-5% och kan utöva betydande toxicitet 27-32. Även om användning av plasmider med en enzymatisk reportersystem kan kringgå problemet med dålig transfektionseffektivitet genom att förstärka signalen, de intediskriminera cellspecifika effekter, och resultaten baseras på en liten cellpopulation som kanske inte är representativa för hela. En annan allmänt använd metod i chick, RCAS virusinfektion, är endast tillämplig på prolifererande celler och därmed inte lämpar sig för detta primära retinal odlingssystem 33.
I det nuvarande protokollet embryonala chick ögon är enucleated i steg 27 (ED 5), det retinala pigmenterade epitel (RPE) avlägsnas, och det retinala koppen placeras i en elektroporation kammare fylld med en plasmid innehållande lösning och elektro använder skräddarsydda elektroder, följt av retinal dissociation och kultur med hjälp av standardtekniker 21. Efter att optimera detta förfarande har vi kunnat uppnå genomgående transfektion effektivitet i storleksordningen 22% av det totala antalet celler i odling och 25% inom ensam ljusmätare befolkningen, utan att kompromissa med överlevnad och differentiering egenskaperkulturer 1. Här ger vi ett detaljerat protokoll beskriver alla viktiga steg i detta förfarande för att säkerställa framgång och reproducerbarhet av denna teknik.
Det mest kritiska steget för att lyckas med detta protokoll är att välja rätt skede av embryon. I tidigare publikationer är en rad av de embryonala stadierna ges för dessa kulturer, vanligtvis definieras av dagars inkubation eller embryonala dagar (ED); därför är det vanligtvis antas att användning av ED 5 till ED 6 embryon kommer att ge likvärdiga resultat. Vi har emellertid funnit att på scenen 27 (ED 5), kommer transfektionseffektiviteten vara runt 22% av den totala cellpopulationen, som nämnts ovan; men…
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge David O’Brien for his support with data analysis, and all the members of the Canto-Soler lab for their critical discussions. This work was supported by NIH grants EY004859 and EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765, and an unrestricted departmental grant from Research to Prevent Blindness, Inc.
ECM 830 Electro Square Porator | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0052 | |
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip | BTX/ Harvard Apparatus | 45-0115 model 512 | Gold tipped electrode used as anode |
Polyimide Tubing | Vention Medical | custom made | Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode |
2.5mm square box filament, 4.5mm wide | Sutter Instrument Company | FB245B | Used to make cathode electrode |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco – Life Technologies | 14175-095 | |
Moloney forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
Dumont tweezers 5/45 | Roboz | RS-5058 | Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length |
Bonn micro forceps, 1×2 teeth | Roboz | RS-5172 | Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75" Length; .3mm Tip Width |