Meten Lokaal Anafylaxie in Muizen

Summary

Allergische reacties, gekenmerkt door de activering van mestcellen en basofielen, worden door de verknoping van IgE en het vrijkomen van pro-inflammatoire mediatoren. Een kwantitatieve beoordeling van allergische reacties kunnen worden bereikt door Evans Blue kleurstof veranderingen in vasculaire permeabiliteit na provocatie met allergeen controleren.

Abstract

Allergische reacties het gevolg zijn van de activatie van mestcellen en basofielen en de daaropvolgende afgifte van vasoactieve en pro-inflammatoire mediatoren. Blootstelling aan een allergeen in een gesensibiliseerd individu kan leiden tot klinische symptomen die variëren van lichte roodheid tot levensbedreigende anafylaxie. In het laboratorium zijn verschillende diermodellen ontwikkeld om de mechanismen die allergische reacties begrijpen. Hierin beschrijven we een gedetailleerde methode voor het meten van veranderingen in vasculaire permeabiliteit gelokaliseerde allergische reacties te kwantificeren. De plaatselijke anafylaxie test werd voor het eerst gemeld in de jaren 1920, en is een aangepaste versie van de techniek gepubliceerd door Kojima et al. in 2007 ^1. Bij deze assay muizen gesensibiliseerd met OVA uitgedaagd in de linker oor met voertuig en in het rechter oor met OVA. Dit wordt gevolgd door een intraveneuze injectie van Evans Blue kleurstof. Tien minuten na het injecteren van Evans Blue, wordt het dier gedood en de kleurstof die in extravasatiede oren wordt een nacht geëxtraheerd in formamide. De absorptie van de geëxtraheerde kleurstof wordt vervolgens gekwantificeerd met een spectrofotometer. Deze werkwijze methode stelselmatig een visuele en kwantificeerbare manifestatie van een lokale allergische reactie.

Introduction

Type I overgevoeligheid wordt gemedieerd door antigeen geïnduceerde verknoping van IgE op het oppervlak van mestcellen en basofielen. Dit resulteert in cellulaire degranulatie en afgifte van vasoactieve en proinflammatoire mediatoren zoals histamine, tryptase en bloedplaatjes activerende factor ^2. Na de afgifte van voorgevormde mediatoren tijdens degranulatie, mestcellen synthetiseren kort prostaglandinen en leukotriënen, die verder toenemen vasculaire permeabiliteit ^3. De eerste klinische respons treedt snel wordt aangeduid als een "onmiddellijke reactie". In de huid, een wheal-en-flare reactie gemakkelijk zichtbaar binnen minuten na provocatie met antigeen. Afhankelijk van de dosis van de challenge, is het mogelijk om een ​​"late fase respons" een paar uur later observeren. Late fase zwelling is het gevolg van lokaal oedeem en rekrutering van leukocyten in de weefsels ^2. Histamine, algemeen beschouwd als de belangrijkste mediator die aan zijnonmiddellijke allergische reacties, werkt in op histamine receptor 1 (HR1) uitgedrukt op schepen en histamine receptor 2 (HR2) uitgedrukt op de gladde spieren. Het gecombineerde effect verhoogt de bloedstroom en vasculaire permeabiliteit op de plaats van ontsteking ^4.

Een verscheidenheid van dierlijke modellen van allergie ontwikkeld om de bij allergische ontsteking mechanismen, met inbegrip van modellen van allergische astma, systemische anafylaxie en lokale anafylaxie bestuderen. Intraveneuze kleurstof administratie is gebruikt om gelokaliseerde allergische reacties in diermodellen meten bijna een eeuw, met publicaties waarin deze techniek dateert uit de jaren 1920 ^5. Konijnen en cavia's waren de eerste diermodellen gebruikt om onmiddellijke overgevoeligheidsreacties te testen, en de meest gevoelige reacties waren over het algemeen gevonden in het oor ^5,6. De bepaling werd later gevalideerd voor gebruik bij ratten en muizen ^{7 8.}

Historisch,verschillende experimentele methoden zijn gebruikt, waaronder injectie van antigen voorafgaand aan de injectie van kleurstof, injectie van kleurstof vóór injectie van antigeen en gelijktijdige injectie van kleurstof en antigeen. Intraveneuze toediening kleurstof als middel voor het meten van allergische reacties is een veelzijdig assay als het kan worden gebruikt voor het meten van actieve, passieve en reverse passieve reacties ^5,9. Tal van kleurstoffen zijn gebruikt om allergische reacties, waaronder trypaanblauw, pontamine Sky Blue, Evans Blue, Geigy Blue 536 en India Ink ^5,6,9 beoordelen. Een oplossing van 0,5% Evans Blue momenteel standaard kleurstof voor het meten van allergische reacties in de huid.

De anafylactische reactie op de uitdaging is van voorbijgaande aard; maximale intensiteit wordt binnen 10 – 15 minuten kleurstof injectie en geen reactie is zichtbaar als kleurstof wordt toegediend meer dan 30 minuten na provocatie, ongeacht de gebruikte diersoorten ^9. Kwantificering van kleurstof extravasatie was oorspronkelijkly verkregen door het meten wheal formaat zoals aangegeven door de blauwe kleurstof ^7-9. Bovendien kan tellingen van degranulated mestcellen worden gekwantificeerd door excisie huidweefsel van de plaats van de reactie en kleuring met toluïdineblauw ^7. Mestceldegranulatie wordt vaak gebruikt als een marker voor cutane, IgE-gemedieerde allergische reacties, zoals mestcellen de belangrijkste lokale celpopulatie expressie hoge affiniteit IgE receptor FcsRI. Spectrofotometrische technieken voor het meten kleurstof extravasatie in het weefsel ontwikkeld voor passieve cutane anafylaxie (PCA) in de rat en de muis ^{11, 10} in de jaren 1990.

De volgende plaatselijke anafylaxie assay protocol werd aangepast van Kojima et al. ¹ en gebruik kippenei ovalbumine (OVA) als antigeen voor het opwekken van allergische reacties. Voor andere dan OVA antigenen worden gebruikt indien gewenst. De assay gebruikt vervolgens Evans Blue kleurstof veranderingen in vasculaire permeabilit volgeny dat door cellen IgE verknopen en histamine afgifte mast voorkomen.

Protocol

1 sensibiliseren Muizen Bereid een OVA voorraadoplossing door verdunning OVA in 1x PBS tot een eindconcentratie van 20 mg / ml. Freeze neer porties in cryovials en bewaar bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Breng een of meer porties van 20 mg / ml OVA stock kamertemperatuur. Verdun OVA in 1x PBS tot een eindconcentratie van 1 mg / ml in 5 ml polystyreen ronde bodem buis met een kap. Vortex kort te mengen. Terwijl de polystyreen buis met de 1 mg / ml OVA op een vortex ingesteld op gemidde…

Representative Results

Dieren die de test met succes hebben ondergaan zal de huid en ogen die blauw lijken te hebben. PBS gesensibiliseerde dieren mag niet reageren op PBS of OVA uitdaging, dus beide oren moet wit (Figuur 1A) blijven. In OVA gesensibiliseerde dieren, het oor ontvangen van de PBS challenge (links) moeten ofwel volledig wit of blauw licht op een gelokaliseerde wijze op de plaats van injectie. Het oor ontvangst van de OVA uitdaging (rechts) moet geleidelijk donkerder blauw geworden tijdens de 10 min na kleurstof…

Discussion

Talrijke merkers van allergische aandoeningen worden gebruikt om de sterkte van allergische responsen na provocatie met allergeen, waaronder veranderingen in niveaus van circulerende histamine, Th2 cytokine productie en celrecrutering in bronchoalveolaire vloeistof in de omgeving van luchtweg challenge beoordelen. Terwijl bewaken veranderingen in deze parameters is van belang voor het bestuderen allergische reacties, hebben biologische markers niet altijd correleert met klinische allergische aandoeningen. De plaatselijk…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31G needle	Terumo	NDC 100861
27G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform