Измерение Местные Анафилаксия у мышей

Summary

Аллергические реакции, характеризующиеся активации тучных клеток и базофилов, приводятся в действие сшивания IgE и выпуска провоспалительных медиаторов. Количественная оценка аллергических реакций может быть достигнуто с помощью Эванс синий краситель для мониторинга изменений в проницаемости сосудов после аллергена.

Abstract

Аллергические реакции являются результатом активации тучных клеток и базофилов, и последующее высвобождение вазоактивных и провоспалительных медиаторов. Воздействие на аллерген в сенсибилизированного лица может привести к клинической симптоматики, которые варьируются от незначительной эритемы, чтобы угрожающих жизни анафилаксии. В лаборатории, различные животные модели были разработаны для понимания механизмов вождения аллергические реакции. Здесь мы опишем подробно метод для измерения изменений в проницаемости сосудов количественно локализованные аллергические реакции. Местный анафилаксии анализ впервые сообщалось в 1920, и была адаптирована от техники, опубликованной Кодзима соавт. в 2007 году ^1. В этом анализе, мыши, чувствительным к OVA оспариваются в левом ухе с автомобиля и в правом ухе с OVA. За этим следует внутривенной инъекции синий краситель Эванса. Десять мин после инъекции Evans Blue, животное забивали и краситель, который вырожденными вк ушам добывается на ночь в формамидом. Поглощение извлеченного красителя затем количественно с помощью спектрофотометра. Этот метод надежно приводит к визуальной и количественной проявление местной аллергической реакции.

Introduction

Тип I гиперчувствительности опосредовано антиген-индуцированного сшивки IgE на поверхности тучных клеток и базофилов. Это приводит к клеточной дегрануляции и освобождение вазоактивных и провоспалительных медиаторов, таких как гистамин, триптазы, и фактор активации тромбоцитов ^2. После выпуска предварительно сформированных посредников во дегрануляции, тучные клетки синтезируют и отпустите простагландины и лейкотриены, которые в дальнейшем увеличить проницаемость сосудов ^3. Начальное клинический ответ происходит быстро и упоминается как "немедленной реакции". В коже, ответ волдыри-и-вспышка хорошо видна в течение нескольких минут антигена. В зависимости от дозы вызов, можно наблюдать "поздно фазовую" несколько час спустя. Поздно фаза отек обусловлен локализованной отека и найма лейкоцитов в ткани ^2. Гистамин, как правило, считается основным медиатором участие вНепосредственные аллергические реакции, действует на рецептором гистамина 1 (HR1) выразил на судах и рецептором гистамина 2 (HR2) выразил на гладкие мышцы. Комбинированный эффект увеличивает приток крови и проницаемость сосудов в участке воспаления ^4.

Разнообразие моделей животных аллергии были разработаны с целью изучения механизмов, участвующих в аллергическом воспалении, в том числе моделей аллергической астмы, системной анафилаксии и местных анафилаксии. Администрация внутривенного краситель был использован для измерения локализованных аллергические реакции на животных моделях в течение почти столетия, с публикации описания этого технику, датируется 1920-х годов ^5. Кролики и морские свинки были первые модели животного происхождения, используемые для тестирования реакции гиперчувствительности немедленного и наиболее чувствительные Ответы, как правило найти в ухо ^5,6. Анализ впоследствии подтверждена для использования в крыс и мышей ^{7 8.}

Исторически сложилось так,Различные экспериментальные методы были использованы, в том числе инъекции антигена перед инъекцией красителя, красителя инъекции до инъекции антигена, и одновременного введения красителя и антигена. Внутривенное введение краситель в качестве средства для измерения аллергические реакции является универсальным для анализа, как он может быть использован для измерения активный, пассивный, и обратный пассивные реакции ^5,9. Многочисленные красители были использованы для оценки аллергические реакции, в том числе трипановым синим, пентамина голубой, Evans Blue, ГЕЙГИ Голубой 536, и тушь ^5,6,9. Раствор 0,5% Evans Blue, в настоящее время стандарт краситель используется для измерения аллергических реакций в коже.

Анафилактический ответ на вызов преходяще; Максимальная интенсивность достигается в течение 10 – 15 мин после инъекции красителя, и никакой реакции не видно, если краситель вводят больше чем 30 минут после вызова, независимо от вида животного, используемых ^9. Количественная оценка экстравазации красителя был оригиналенлы получают путем измерения волдырь размер, как указано синего красителя ^7-9. Кроме того, на счету дегранулированных тучных клеток может быть определена количественно путем вырезания кожной ткани от места реакции и окрашивания толуидиновым синим ^7. Мачты дегрануляции клеток часто используется в качестве маркера для кожного, IgE-опосредованные аллергические реакции, как тучные клетки являются основным местным населением клетки, экспрессирующей высокое сродство рецептора IgE FcεRI. Спектрофотометрические методы измерения красителя экстравазацию в ткань были разработаны для пассивных кожной анафилаксии (СПС) у крыс ¹⁰ и мыши ¹¹ в 1990-х годах.

Следующий протокол местной анафилаксии анализ был адаптирован из Kojima соавт. ^1, и использует куриные яйца яичный альбумин (OVA) в качестве антигена для выявления аллергических реакций. Тем не менее, другие, чем OVA антигены могут быть использованы, если это необходимо. Анализ затем использует синий краситель Эванса отслеживать изменения в сосудистой permeabilitу, что происходит в связи с тучных клеток IgE сшивание и высвобождение гистамина.

Protocol

1. привлечь внимание Мыши Подготовка исходного раствора OVA OVA путем разбавления в 1х PBS до конечной концентрации 20 мг / мл. Замораживание вниз аликвоты в криопробирки и хранить при температуре -80 ° C для дальнейшего использования. Доведите один или несколько аликвот 20 мг / мл OVA с?…

Representative Results

Животные, которые успешно прошли на анализ будет иметь кожу и глаза, которые появляются синие. PBS сенсибилизированных животных не должны реагировать на любой PBS или OVA вызов, поэтому оба уха должна оставаться белой (1А). В OVA сенсибилизированных животных, ухо приема вызов PBS (слева…

Discussion

Многочисленные маркеры аллергических заболеваний используются для оценки силы аллергических реакций следующих аллергена, включая изменения в уровнях циркулирующего гистамина, Th2 продукции цитокинов, а также набора клеток в бронхоальвеолярном жидкости в проточных частях вызов дыха?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31G needle	Terumo	NDC 100861
27G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform