Mätning Lokala Anafylaxi i möss

Summary

Allergiska reaktioner, som kännetecknas av aktivering av mastceller och basofiler, drivs av tvärbindning av IgE och frisättning av proinflammatoriska mediatorer. En kvantitativ bedömning av allergiska responser kan uppnås genom användning av Evans Blue färgämne för att övervaka förändringar i vaskulär permeabilitet efter allergenutmaning.

Abstract

Allergiska reaktioner är resultatet av aktivering av mastceller och basofiler och efterföljande frisättning av vasoaktiva och proinflammatoriska mediatorer. Exponering för ett allergen i en sensibiliserad individ kan leda till kliniska symtom som varierar från mindre erytem till livshotande anafylaxi. I laboratoriet har olika djurmodeller utvecklats för att förstå mekanismerna som driver allergiska reaktioner. Häri beskriver vi en detaljerad metod för att mäta förändringar i vaskulär permeabilitet för att kvantifiera lokaliserade allergiska svar. Den lokala anafylaxi analysen rapporterades först på 1920-talet, och har anpassats från den teknik som publicerats av Kojima et al. 2007 ^1. I denna analys är möss sensibiliserade mot OVA utmanas i vänster öra med bil och i höger öra med OVA. Detta följs av en intravenös injektion av Evans Blue färgämne. Tio minuter efter injicering Evans Blue, är djuret avlivas och färgämnet som extravaserat itill öronen utvinns natten i formamid. Absorbansen för det extraherade färgämnet kvantifieras sedan med en spektrofotometer. Denna metod resulterar pålitligt i en visuell och kvantifierbar manifestation av en lokal allergisk reaktion.

Introduction

Typ I överkänslighet medieras av antigeninducerad tvärbindning av IgE på ytan av mastceller och basofiler. Detta resulterar i cellulär degranulering och frisättning av vasoaktiva och proinflammatoriska mediatorer såsom histamin, tryptas, och blodplättsaktiverande faktor ^2. Efter lanseringen av förformade mediatorer vid degranulering, mastceller syntetiserar och frigör prostaglandiner och leukotriener, vilket ytterligare öka vaskulär permeabilitet ^3. Den initiala kliniska svaret sker snabbt och refereras till som en "omedelbar reaktion". I huden, är en wheal-och-flare svar väl synlig inom några minuter av antigen. Beroende på dosen av utmaningen, är det möjligt att observera en "sena svaret" några timmar senare. Sen fas svullnad beror på lokalt ödem och leukocytrekrytering i vävnaderna ^2. Histamin, som allmänt anses vara den huvudsakliga medlaren deltar iomedelbara allergiska reaktioner, verkar på histaminreceptor 1 (HR1) uttryckt på fartyg och histamin-receptor 2 (HR2) uttryckt på glatt muskulatur. Den kombinerade effekten ökar blodflödet och vaskulär permeabilitet vid inflammationsstället ^4.

En mängd olika djurmodeller av allergi har utvecklats i syfte att studera de mekanismer som är inblandade i allergisk inflammation, inklusive modeller av allergisk astma, systemisk anafylaxi, och lokala anafylaxi. Intravenös färgämne administration har använts för att mäta lokala allergiska reaktioner i djurmodeller för nästan ett sekel, med publikationer som beskriver denna teknik med anor från 1920-talet ^5. Kaniner och marsvin var de första djurmodeller används för att testa omedelbara överkänslighetsreaktioner, och de mest känsliga responser i allmänhet finns i örat ^5,6. Analysen senare validerats för användning i råttor ⁷ och möss ^8.

Historiskten mängd olika experimentella metoder har använts, inklusive injektion av antigen före injektion av färgämne, injektion av färgämne före injektionen av antigen, och samtidig injektion av färgämne och antigenet. Intravenös färgämne administrering som ett medel för mätning av allergiska svar är en mångsidig analys såsom den kan användas för mätning av aktiva, passiva, och omvända passiva reaktioner ^5,9. Många färgämnen har använts för att bedöma allergiska reaktioner, inklusive trypanblått, Pontamine Sky Blue, Evans Blue, Geigy Blue 536, och Indien bläck ^5,6,9. En lösning av 0,5% Evans Blue är för närvarande standard färgämne som används för mätning av allergiska reaktioner i huden.

Den anafylaktisk reaktion på utmaningen är övergående; maximal intensitet nås inom 10 – 15 min för färginjektion, och ingen reaktion är synlig om färgämne administreras mer än 30 minuter efter provokation, oberoende av de djurarter som används ^9. Kvantifiering av färgämne extravasation var originally erhållas genom att mäta strimmigt storlek såsom indikeras av det blåa färgämnet ^7-9. Dessutom kan räkningar av degranulated mastceller kvantifieras genom utskärning hudvävnad från platsen för reaktionen och färgning med toluidinblått ^7. Mastcelldegranulering används ofta som en markör för kutan, IgE-medierade allergiska reaktioner, eftersom mastceller är den viktigaste lokala cellpopulation som uttrycker högaffinitets IgE-receptorn FcsRI. Spektrofotometriska tekniker för att mäta färgextravasation in i vävnaden utvecklades för passiva kutana anafylaxi (PCA) i råtta ¹⁰ och mus ¹¹ på 1990-talet.

Följande lokala anafylaxi analysprotokoll anpassades från Kojima et al. ^1, och utnyttjar hönsägg ovalbumin (OVA) som antigen för framkallande allergiska reaktioner. Emellertid kan andra än OVA-antigener användas om så önskas. Analysen använder sedan Evans Blue färgämne för att övervaka förändringar i vaskulär permeability som uppstår på grund av mastcell IgE tvärbindning och histaminfrisättning.

Protocol

1. sensibilisera möss Bered en OVA stamlösning genom utspädning OVA i 1x PBS till en slutkoncentration av 20 mg / ml. Frys ner alikvoter i cryovials och förvara vid -80 ° C för framtida bruk. Ta med en eller flera portioner av 20 mg / ml OVA lager till rumstemperatur. Späd OVA i 1x PBS till en slutlig koncentration av 1 mg / ml i en 5 ml polystyren rundbottnad rör med ett lock. Kort Vortex att blanda. Håll i polystyrenrör innehållande 1 mg / ml OVA på en vortex inställd på me…

Representative Results

Djur som har genomgått analysen med framgång kommer att ha hud och ögon som visas blå. PBS sensibiliserade djur bör inte reagera på antingen PBS eller OVA utmaning, därför båda öronen bör förbli vit (Figur 1A). I OVA sensibiliserade djur, örat tar emot PBS utmaningen (vänster) bör vara antingen helt vita eller lätt blå i en lokal sätt vid injektionsstället. Örat tar emot OVA utmaningen (höger) bör bli gradvis mörkare blått under 10 min efter färg administration (Figur 1B…

Discussion

Många markörer för allergisk sjukdom används för att bedöma styrkan av allergiska reaktioner efter allergenprovokation, inklusive förändringar i nivåer av cirkulerande histamin, Th2 cytokinproduktion och cellrekrytering till bronkoalveolär vätska i fastställandet av luftvägs utmaning. Medan övervakning av förändringar i dessa parametrar är viktiga för att studera allergiska reaktioner, behöver biologiska markörer inte alltid korrelerar med klinisk allergisk sjukdom. Den lokala anafylaxi analys som be…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31G needle	Terumo	NDC 100861
27G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform