Experimentele en Imaging technieken voor de behandeling fibrinestolsel Structuren in normale en zieke Staten
Summary
In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.
Abstract
Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.
Introduction
Letsel aan endotheliale bekleding van een bloedvat wordt hersteld door de hemostatische reactie of de vorming van een bloedstolsel. Wanneer bloed doordringt in de extracellulaire matrix, weefselfactoren activeert bloedplaatjes stroom die initiatie van de coagulatie cascade vergemakkelijken. De belangrijkste mechanische componenten van dit genezingsproces is de fibrine matrix, samengesteld uit fibrine vezels die zeer elastisch, en kan grote krachten 1-4 ondersteunen. Veel onderzoekers hebben de vorming van structuur en functie van fibrine uitgebreid bestudeerd in de afgelopen decennia 5-13.
Patiënten met ziekten zoals diabetes mellitus en sikkelcel hebben een verhoogd risico op trombotische complicaties zoals myocardinfarct, ischemische hartziekte, en lijnen 14-19. Meer dan 2 miljoen mensen zijn met nieuw gediagnosticeerde diabetes mellitus elk jaar in de Verenigde Staten. Er zijn twee types van diabetes: Type I, waarbij delichaam niet in slaagt om voldoende hoeveelheden insuline, en type II, waar het lichaam resistent wordt voor insuline te produceren. Bij patiënten met diabetes, cardiovasculaire ziekte (CVD) is de oorzaak van 80% van de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met de ziekte 20,21.
Sikkelcelziekte (SCZ) is een erfelijke bloedziekte die meer dan 100.000 mensen in de Verenigde Staten 22 beïnvloedt. SCD is een puntmutatie ziekte die rode bloedcellen veroorzaakt halvemaanvormige worden, waardoor het moeilijk voor de cellen door het bloed vasculatuur 23 te passen. Beide ziekten vergroten de kans op het ontwikkelen atherotrombotische omstandigheden in het lichaam. Eén van de redenen hiervoor is een gevolg van veranderde fibrine structuur en functie in zieke toestanden 14,24-26.
Zowel diabetes en sikkelcelziekte, is hypercoagulatie en hypofibrinolysis activiteit die atherotrombose en cardiovasculaire ziekte induceert (CVD) in vergelijking met gezonde patiënten 17,27,28. Het is bekend dat hypofibrinolysis bevordert progressie van atherosclerose en wekt terugkerende ischemische gebeurtenissen voor patiënten met premature kransslagaderziekte 29. In de huidige manuscript, onderzochten we de rol van fibrine fysische eigenschappen in deze specifieke setting. Fibrinestolsel structuren niet zieke patiënten bestaan uit dunne vezels, grotere poriën, en meestal minder dichte 14,24. De toegenomen porositeit en minder dichte fibrinestolsels bij gezonde patiënten zijn gevonden fibrinolyse 16 vergemakkelijken. In hyperthrombotic aandoeningen zoals diabetes en sikkelcelziekte, is er een toename van fibrinogeen productie, waardoor het fibrinogeen concentratie toenemen van normale niveaus van 2,5 mg / ml bij gezonde patiënten 30-33. Fibrine stolsels gevormd in diabetespatiënten gevonden minder poreus, stijver te zijn, meer vertakkingspunten en dichtere vergelijking met gezonde, niet-diabetic patiënten 14,24,33-35. De gewijzigde fibrine structuur is een gevolg van glycosylering mechanismen die optreden in de bij stolselvorming eiwitten. Niet-enzymatische (onomkeerbare) glycation treedt op wanneer glucose moleculen binden aan lysine residuen op de fibrinogeen molecuul, dat menselijke factor XIII bis (FXIIIa) niet goed verknoping glutamine en lysineresiduen 33,36,37 remt.
De structuuranalyse van fibrine netwerk is uitgebreid recent bestudeerd. In het bijzonder hebben onderzoekers elektronenmicroscopie en 3D reconstructie van fibrine netwerken 38, onderzocht hoe zowel intravasculaire (endotheel) cellen en extravasculaire (fibroblasten en gladde spier) cellen beïnvloeden fibrine structuur 39, gebruikt viscoelastische en spectraalanalyse in fibrine structuren 40 analyseren, en benut ontwikkelde correlaties tussen fibrine structuur en mechanische eigenschappen met behulp van experimentele en computationele benaderingen 41 </sup>. De focus van de huidige studie was om te stollen structuren te formuleren onder gesimuleerde diabetische en sikkelcelziekte trombose voorwaarden en confocale microscopie te gebruiken voor onderzoek naar de structuur en functie van de stolsels in zieke toestanden. Fibrinestolsels gevormd uit humaan fibrinogeen, humaan trombine en FXIIIa. De stolsels werden gelyseerd met plasmine. Om diabetesvoorwaarden simuleren, verhoogde concentratie van fibrinogeen werd geïncubeerd in glucoseoplossing in vitro fibrinogeen glycatie induceren. Aan sikkelcelanemie stolling omstandigheden te simuleren, werden verhoogd fibrinogeen concentraties gemengd met sikkelcelziekte hematocriet verzameld van patiënten zoals eerder gedaan door onze groep 42. Deze methoden werden gebruikt om de structuur en functies betrokken in fibrine stolselvorming en fibrinolyse onder ziektetoestanden, alsmede de mechanismen die CVD induceren onderzocht. Op basis van de huidige informatie over deze ziekten, de geglyceerde fibrinestolsel structuren waren dichter met minder eennd kleinere poriën. De fibrine stolsels met rode bloedcellen van sikkelcel patiënten (RBC) werden ook dichter en weergegeven aggregatie van de rode bloedcellen en fibrine geagglomereerde clusters. Dit is een gevestigde verschijnsel dat eerder 43 bepaald. Ook werd verondersteld dat de fibrinolyse percentage significant lager in geglyceerd fibrinestolsels met en zonder verminderde plasmine vergelijking met gezonde, normale fibrine is. De resultaten toonden dat voor geglycosileerd fibrinestolsels significant verschillend lysis coëfficiënt resulteert alleen in omstandigheden van verminderde concentratie plasmine waargenomen. Deze experimentele techniek van het gebruik van confocale microscopie biedt aanzienlijke voordelen boven andere beeldvormende technieken omdat de cellen en eiwitten blijven in hun natieve toestand, waarbij het vangen van real-time video van de stollingsactiviteit mogelijk maakt. Deze methode van synthetisch inducerende stolling is ook goedkoper en meer tijd efficiënter dan het verkrijgen van monsters van patiënten en te filteren op individueleeiwitten en enzymen. Bovendien, door gescheiden eiwitten en enzymen om stolsels synthetiseren, de stolsels werden gestandaardiseerd zodat er geen variabiliteit tussen monsters als gevolg van andere eiwitten in het plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om zinvolle gegevens over de structuur van stollingsmechanismen bij ziektetoestanden verkrijgen, is het belangrijk om de bij stolling om de effecten van de eiwitten en cellen onder deze omstandigheden vast factoren te isoleren. Dit protocol werd ontwikkeld ten behoeve van onderzoek naar de structuur van de fibrine klonter in diabetische cardiomyopathie toestanden in vitro.
Het is noodzakelijk om de bij de vorming van fibrine en fibrinolyse bij ziektetoestanden aangezien veranderde o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS | Life Technologies | 10010031 | |
| Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) | GE Healthcare | 45-001-749 | |
| 10 ml heparinized vacutainer tubes | BD Biosciences | 366643 | |
| Human Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate | Molecular Probes | F13191 | |
| 0.5 mL graduated microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Glucose powder | Life Technologies | 15023-02 | |
| FXIIIa | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| VIS Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
| 50 mM Tris | Lonza | S50-642 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| Vybrant DiD cell-labeling solution | Life Technologies | L7781 | |
| Plasmin | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Sodium Chloride (5 M NaCl) | Life Technologies | AM9759 | |
| Statistical Modeling Software | IBM | SPSS Statistics 22 |
References
- Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
- Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
- Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
- Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
- Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
- Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
- Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
- Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
- Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
- Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
- Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
- Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
- Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
- Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
- Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
- Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
- Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
- Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
- Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
- Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
- Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
- Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
- Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
- Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
- Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
- Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
- Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
- Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
- Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
- Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
- Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
- Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
- Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
- Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
- Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
- Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781 (2012).
- Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212 (1957).
- Kuehl, R. O. . Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , (2000).
- Lindman, H. R. . Analysis of variance in experimental designs. , (1992).
- Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
- Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
- Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, 45 (1998).
