Experimentelle und Bildgebende Verfahren für die Prüfung Fibringerinnsel Strukturen in normalen und erkrankten Staaten

Summary

In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.

Abstract

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.

Introduction

Schädigung eines Blutgefäßes Endothelauskleidung durch die hämostatische Reaktion oder die Bildung eines Blutgerinnsels repariert. Wenn Blut dringt in die extrazelluläre Matrix, Gewebefaktoren aktiviert Blutplättchen in den Blutstrom, die Einleitung der Gerinnungskaskade zu erleichtern. Der Schlüssel mechanische Komponente dieser Heilungsprozess ist die Fibrinmatrix, von Fibrin Fasern, die hochelastisch sind zusammengesetzt und kann große Kräfte ^1-4 zu erhalten. Viele Forscher haben die Bildung Struktur und Funktion von Fibrin ausführlich in den vergangenen Jahrzehnten ^5-13 untersucht.

Patienten mit Krankheiten, wie Diabetes mellitus und Sichelzellen ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von thrombotischen Komplikationen wie Herzinfarkte, ischämische Herzerkrankungen und Schlaganfälle ^14-19. Über 2 Millionen Menschen neu mit Diabetes mellitus diagnostiziert jedes Jahr in den Vereinigten Staaten. Es gibt zwei Arten von Diabetes: Typ I, wo dieKörper nicht ausreichende Mengen an Insulin und Typ II, wo der Körper wird resistent gegen Insulin zu produzieren. Unter Diabetikern, kardiovaskulärer Erkrankung (CVD) ist die Ursache für die 80% der Morbidität und Mortalität, die mit der Krankheit assoziiert ^20,21.

Sichelzellanämie (SCD) ist eine genetisch bedingte Blutgerinnungsstörung, die mehr als 100.000 Menschen in den Vereinigten Staaten ²² wirkt. SCD ist eine Punkt-Mutation Krankheit, die roten Blutkörperchen bewirkt, halbmondförmige geworden, dass es schwierig für die Zellen durch die Blutgefäßsystem ²³ übergeben. Beide Krankheitszuständen erhöht die Chancen der Entwicklung atherothrombotischer Bedingungen im Körper. Einer der Gründe dafür ist, auf einer veränderten Fibrin Struktur und Funktion in erkrankten Zuständen ^14,24-26.

In beiden Diabetes und Sichelzellanämie, gibt es Hyperkoagulation und Hypofibrinolyse Aktivität, die Atherothrombose und kardiovaskulären Erkrankungen induziert (CVD) im Vergleich zu gesunden Patienten ^17,27,28. Es ist bekannt, dass Hypofibrinolyse fördert Atherosklerose Progression und erzeugt rezidivierende ischämische Ereignisse bei Patienten mit vorzeitigem Koronararterienerkrankung ^29. In der aktuellen Manuskript untersuchten wir die Rolle von Fibrin physikalischen Eigenschaften in diesem besonderen Ambiente. Fibringerinnsel Strukturen in nicht erkrankten Patienten werden von dünnen Fasern, größere Poren, und in der Regel weniger dicht ^14,24 zusammen. Die erhöhte Porosität und weniger dicht Fibringerinnseln in gesunden Patienten wurde gefunden, dass die Fibrinolyse ¹⁶ erleichtern. In hyperthrombotischen Bedingungen wie diabetische und Sichelzellanämie, gibt es eine Erhöhung in der Produktion von Fibrinogen, wodurch der Fibrinogenkonzentration um vom Normalniveau von 2,5 mg / ml in gesunden Patienten ^30-33 erhöhen. Fibringerinnseln in diabetischen Patienten gebildet haben sich als weniger porös, steifer, mehr Verzweigungspunkte, und dichter im Vergleich zu gesunden, nicht-diaBetic Patienten ^14,24,33-35. Die veränderte Fibrinstruktur ist ein Ergebnis der Glykierung Mechanismen, die in den Proteinen der Gerinnselbildung beteiligt auftreten. Nichtenzymatische (irreversibel) Glykosylierung tritt auf, wenn Glukose-Moleküle binden an Lysinresten auf der Fibrinogen-Molekül, das die menschliche Faktor XIIIa (FXIIIa) ordnungsgemäß Vernetzungs Glutamin und Lysin-Reste ^33,36,37 hemmt.

Die Strukturanalyse von Fibrin-Netzwerken wurde ausgiebig vor kurzem untersucht. Insbesondere haben Forscher Elektronenmikroskopie und 3D-Rekonstruktion von Fibrin-Netzwerken ^38, untersucht, wie auch intravaskuläre (endotheliale Zellen) und extravaskuläre (Fibroblasten und glatte Muskelzellen) Zellen beeinflussen Fibrinstruktur ^39, verwendet viskoelastischen und Spektralanalyse zu Fibrin Strukturen ⁴⁰ analysiert und verwendet entwickelten Korrelationen zwischen Fibrin Struktur und mechanischen Eigenschaften mit experimentellen und theoretischen Ansätze ⁴¹ </sup>. Der Fokus der vorliegenden Studie war es Gerinnsel Strukturen unter simulierten diabetischen und Sichelzellen Thrombose Bedingungen formulieren und konfokale Mikroskopie zur Untersuchung der Struktur und Funktion der Blutgerinnsel in Krankheitszuständen verwendet werden. Fibringerinnsel wurden aus menschlichem Fibrinogen, humanes Thrombin und FXIIIa gebildet. Die Gerinnsel wurden mit Plasmin lysiert. Diabetischer Bedingungen zu simulieren, wurde erhöhte Konzentration an Fibrinogen in der Glukoselösung inkubiert, um eine in vitro Glykierung Fibrinogen induzieren. Um Sichelzellanämie Gerinnungsbedingungen zu simulieren, wurden erhöhte Fibrinogenkonzentrationen mit Sichelzellen Hämatokrit von Patienten gesammelt, wie zuvor von unserer Gruppe ⁴² getan gemischt. Diese Verfahren wurden verwendet, um die Struktur und die Funktionen in Fibringerinnselbildung und Fibrinolyse bei Krankheitszuständen beteiligt sind, sowie die Mechanismen, die CVD induzieren zu untersuchen. Basierend auf den aktuellen Informationen über diese Krankheiten waren die glykosylierten Fibringerinnsel Strukturen dichter mit weniger einnd kleineren Poren. Die Fibringerinnsel mit roten Blutzellen von Sichelzellpatienten (RBCs) wurden ebenfalls dichter und angezeigt Aggregation der Erythrozyten und agglomeriert Fibrin Clustern. Dies ist ein gut etabliertes Phänomen, das zuvor ⁴³ festgestellt hat. Es wurde auch vermutet, dass die Fibrinolyse Quote wäre in glykosylierten Fibringerinnsel mit und ohne reduzierte Plasmin im Vergleich zu gesunden, normalen Fibrin deutlich geringer. Die Ergebnisse zeigten, dass für glykosyliertes Fibringerinnseln, signifikant Lyserate Ergebnisse wurden nur unter den Bedingungen einer reduzierten Plasminkonzentration beobachtet. Dieses experimentelle Technik der Verwendung der konfokalen Mikroskopie bietet signifikante Vorteile gegenüber anderen bildgebenden Verfahren, weil die Zellen und Proteine ​​in ihrem nativen Zustand, der die Erfassung von Echtzeitvideo der Gerinnungsaktivität ermöglicht bleibt. Diese Methode synthetisch induzierenden Blutgerinnung ist auch billiger und zeiteffizienter als Erhalt von Patientenproben und Ausfiltern einzelneProteine ​​und Enzyme. Ferner ergeben sich mit getrennten Proteine ​​und Enzyme, um Gerinnsel zu synthetisieren, die Gerinnsel wurden standardisiert, so dass es nicht die Variabilität zwischen den Proben als Folge von anderen Proteinen im Plasma.

Protocol

HINWEIS: Das folgende Protokoll befolgt die vom Institutional Review Board (IRB) an der Georgia Tech Richtlinien. 1. Blutentnahme und Rotes Blutkörperchen Isolierungsverfahren Sammeln Sie 40 bis 120 ml Blut von Spendern in 10 ml Heparin-Vacutainer-Röhrchen. Starten PBMC (periphere Blut mononukleären Zellen) Isolierung innerhalb von 4 Stunden der Sammlung. Während dieser Zeit halten Blut bei RT. HINWEIS: O / N Lagerung von Blut in RT oder bei 4 ° C wird nicht</s…

Representative Results

Konfokale Mikroskopie Analyse der Glykiertes Fibringerinnsel Strukturen Konfokales Mikroskopiebilder von normalen und glykiertem Blutgerinnsel sind in Abbildung 3 dargestellt. Die konfokale Mikroskopie-Analyse der normalen und glykiertem Blutgerinnsel zeigt, dass glykiertes Blutgerinnsel sind dichter mit kleineren Poren als die normalen Gerinnsel sowohl mit als auch ohne Zusatz von FXIIIa während der Gerinnsel Polymerisation. In 3A und 3B ist</stron…

Discussion

Um aussagekräftige Daten über die Struktur des Gerinnungsmechanismen bei Krankheitszuständen zu erhalten, ist es wichtig, die Faktoren der Blutgerinnung beteiligt sind, um die Effekte der Proteine ​​und Zellen unter diesen Bedingungen zu bestimmen, zu isolieren. Dieses Protokoll wurde zum Zweck der Untersuchung der Struktur des Fibringerinnsels bei diabetischen und SCD Zustände in vitro entwickelt.

Es ist notwendig, um die Mechanismen in der Fibrinbildung und Fibrinolyse bei…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
PBS	Life Technologies	10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)	GE Healthcare	45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes	BD Biosciences	366643
Human Fibrinogen	Enzyme Research Laboratories	N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate	Molecular Probes	F13191
0.5 mL graduated microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-120
Glucose powder	Life Technologies	15023-02
FXIIIa	Enzyme Research Laboratories	N/A
VIS Confocal Microscope	Zeiss LSM 510	LSM 510
50 mM Tris	Lonza	S50-642
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution	Life Technologies	L7781
Plasmin	Enzyme Research Laboratories	N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl)	Life Technologies	AM9759
Statistical Modeling Software	IBM	SPSS Statistics 22