Experimentella och avbildningsmetoder för att pröva fibrinpropp Structures i normala och sjuka stater

Summary

In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.

Abstract

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.

Introduction

Skada på ett blodkärl s endotelbeklädnaden repareras genom den hemostatiska svar, eller bildningen av en blodpropp. När blodet tränger in i den extracellulära matrisen, vävnadsfaktorer aktiverar blodplättar i blodet som underlättar initiering av koagulationskaskaden. Nyckeln mekaniska komponenten i denna läkningsprocessen är fibrinmatrisen, sammansatt av fibrin fibrer som är mycket elastisk och kan upprätthålla stora krafter ^1-4. Många forskare har studerat bildandet struktur och funktion av fibrin i stor utsträckning i de senaste decennierna ^5-13.

Patienter med sjukdomar som diabetes mellitus och sickle cell har en ökad risk att utveckla trombotiska komplikationer såsom hjärtinfarkt, ischemisk hjärtsjukdom, och stroke ^14-19. Över 2 miljoner människor är nyligen diagnostiserats med diabetes mellitus varje år i USA. Det finns två typer av diabetes: typ I, där denorgan underlåter att producera tillräckliga mängder insulin, och typ II, där kroppen blir resistent mot insulin. Bland patienter med diabetes, är hjärt-kärlsjukdom (CVD) orsaken till 80% av sjuklighet och dödlighet i samband med sjukdomen ^20,21.

Sicklecellanemi (SCD) är en genetisk blodsjukdom som drabbar mer än 100.000 människor i USA ^22. SCD är en punkt-mutation sjukdom som orsakar röda blodkroppar för att bli halvmånformad, vilket gör det svårt för cellerna att passera genom blodvaskulaturen ^23. Båda dessa sjukdomstillstånd ökar chanserna att utveckla aterotrombotiska förhållanden i kroppen. En av anledningarna till detta är ett resultat av förändrad fibrin struktur och funktion i sjukdomstillstånd ^14,24-26.

I både diabetes och sicklecellanemi, det finns hyperkoagulation och hypofibrinolysis aktivitet som inducerar aterotrombos och hjärt-kärlsjukdom (CVD) jämfört med friska patienter ^17,27,28. Det är känt att hypofibrinolysis främjar ateroskleros progression och alstrar återkommande ischemiska händelser för patienter med prematur kranskärlssjukdom ^29. I den aktuella manuskriptet, undersökte vi den roll som fibrin fysikaliska egenskaper i denna särskilda miljö. Fibrinkoagel strukturer i icke-sjuka patienter består av tunna fibrer, större porer och generellt mindre tät ^14,24. Den ökade porositet och mindre täta fibrinkoagel hos friska patienter har visat sig underlätta fibrinolys ^16. I hyperthrombotic förhållanden såsom diabetiker och sicklecellanemi, det finns en ökning av fibrinogen produktion, vilket gör att fibrinogenkoncentration öka från normala nivåer av 2,5 mg / ml hos friska patienter ^30-33. Fibrinkoagel bildas i diabetiska patienter har befunnits vara mindre porös, styvare, har fler förgreningspunkter, och tätare i jämförelse med friska, icke-diaBetic patienter ^14,24,33-35. Den förändrade fibrin struktur är ett resultat av glykation mekanismer som förekommer i de proteiner som är involverade i koagelbildning. Icke-enzymatisk (irreversibel) glykation uppstår när glukosmolekyler binder till lysinrester på fibrinogenmolekylen, vilket hämmar mänskliga faktorn Xllla (FXIIIa) från rätt tvärbindnings glutamin och lysinrester ^33,36,37.

Den strukturella analysen av fibrin-nät, har studerats i stor omfattning på senare tid. I synnerhet har forskarna utnyttjat elektronmikroskopi och 3D-rekonstruktion av fibrin nätverk ^38, undersöktes hur både intravaskulära (endotelceller) celler och extravaskulära (fibroblaster och glatta muskelceller) celler påverkar fibrin struktur ^39, utnyttjad viskoelastiska och spektralanalys att analysera fibrin strukturer ^40, och utvecklade korrelationer mellan fibrin struktur och mekaniska egenskaper med hjälp av experimentella och beräknings närmar ⁴¹ </sup>. Fokus för den aktuella studien var att formulera koagel strukturer under simulerade diabetiker och skäran cell trombos förhållanden och använda konfokalmikroskopi för undersökning av struktur och funktion av blodproppar i sjukdomstillstånd. Fibrinkoagel bildades från humant fibrinogen, humant trombin, och FXIIIa. De blodproppar lyserades med hjälp av plasmin. För att simulera diabetes villkor, ökades koncentrationen av fibrinogen inkuberas i glukoslösning för att inducera in vitro fibrinogen glykation. För att simulera sicklecellanemi koagulering förhållanden, höjdes fibrinogenkoncentrationer blandat med sickle-cell hematokrit samlats in från patienter som gjort tidigare av vår grupp ^42. Dessa metoder användes för att undersöka struktur och funktioner som är involverade i fibrinkoagel bildning och fibrinolys i sjuka förhållanden, samt de mekanismer som inducerar CVD. Baserat på aktuell information om dessa sjukdomar, de glykerade fibrinkoagel strukturer var tätare med färre and mindre porer. De fibrinkoagel med röda blodkroppar från sicklecellpatienter (RBC) var också tätare och visas aggregering av RBC och agglomererade fibrin kluster. Detta är en väletablerad företeelse som har bestämts tidigare ^43. Det var också en hypotes att fibrinolys takten skulle vara betydligt lägre i glykerade fibrinkoagel med och utan minskad plasmin jämfört med friska, normala fibrin. Resultaten visade att för glycerade fibrinkoagel, var signifikant olika lys ränta resultat observerades endast under förhållanden med reducerad plasmin koncentration. Denna experimentella tekniken att använda konfokalmikroskopi erbjuder betydande fördelar jämfört med andra avbildningsmetoder eftersom cellerna och proteiner förblir i sitt nativa tillstånd, vilket möjliggör upptagning av video i realtid av koagulationsaktivitet. Denna metod för syntetiskt inducerande koagulering är också billigare och mer tidseffektivt än att få patientprover och filtrera bort individuellaproteiner och enzymer. Vidare, genom att använda separerade proteiner och enzymer för att syntetisera proppar ades proppar standardiserade så att det inte fanns variabilitet mellan prover som ett resultat av andra proteiner i plasmat.

Protocol

OBS: Följande protokoll följer de riktlinjer som fastställts av Institutional Review Board (IRB) vid Georgia Tech. 1. Blod Insamling och röda blodkroppar Isolering Tillvägagångssätt Samla 40-120 ml blod från givare i 10 ml hepariniserade vacutainerrör. Starta PBMC (perifert blod mononukleära celler) isolering inom 4 timmar för insamlingen. Under denna tid, hålla blod vid RT. OBS: O / N lagring av blod i RT eller 4 ° C rekommenderas inte efterso…

Representative Results

Konfokalmikroskopi Analys av glykerat fibrinkoagel Strukturer De konfokalmikroskopi bilder av normala och glykerade proppar presenteras i Figur 3. Konfokalmikroskopi analys av de normala och glykerade proppar avslöjar att glycerade proppar är tätare med mindre porer än de normala blodproppar både med och utan tillägg av FXIIIa under koagel polymerisation. I fig 3A och 3B, det finns en lägre fibrin koncentration som skapade en mindre t…

Discussion

För att få meningsfulla uppgifter om strukturen på koagulering mekanismer i sjukdomstillstånd, är det viktigt att isolera de faktorer som koagulering att bestämma effekterna av proteiner och celler i dessa villkor. Detta protokoll har utvecklats i syfte att undersöka strukturen fibrinkoaglet hos diabetiker och SCD stater in vitro.

Det är nödvändigt att förstå de mekanismer som är involverade i fibrinbildning och fibrinolys vid sjukdomstillstånd sedan förändrade förh…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
PBS	Life Technologies	10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)	GE Healthcare	45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes	BD Biosciences	366643
Human Fibrinogen	Enzyme Research Laboratories	N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate	Molecular Probes	F13191
0.5 mL graduated microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-120
Glucose powder	Life Technologies	15023-02
FXIIIa	Enzyme Research Laboratories	N/A
VIS Confocal Microscope	Zeiss LSM 510	LSM 510
50 mM Tris	Lonza	S50-642
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution	Life Technologies	L7781
Plasmin	Enzyme Research Laboratories	N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl)	Life Technologies	AM9759
Statistical Modeling Software	IBM	SPSS Statistics 22