Isolering og bruger sektioner af Bovin mesenterialarterie og Vein som et bioassay til at teste for Vasoactivity i tyndtarmen

Summary

Tyndtarmen ofte udsat for giftstoffer, der kan påvirke blodgennemstrømningen og negativ indflydelse optagelsen af ​​næringsstoffer. Ved hjælp af en multimyograph og mesenterialarterie og vene isolater, forbindelser eller toksiner af interesse kan screenes for vasoactivity.

Abstract

Pattedyrreplikationssystemer gastrointestinale systemer er konstant udsat for forbindelser (ønskede og uønskede), der kan have en effekt på blodgennemstrømningen til og fra dette system. Ændringer i blodtilførslen til tyndtarmen kan medføre virkninger på absorberende funktioner organet. Særlig interesse i toksiner befriet fra foder gennem fermentative og fordøjelse har udviklet sig i drøvtyggere som et område, hvor produktive effektivitet kunne forbedres. Videoen er forbundet med denne artikel beskriver en in vitro bioassay udviklet til at screene forbindelser til vasoactivity i isolerede tværsnit af kvæg mesenterialarterie og vene ved hjælp af en multimyograph. Når blodkarrene er monteret og ækvilibreret i myograph kan bioassayet selv anvendes: som et screeningsværktøj til at vurdere den kontraktile respons eller vasoactivity af forbindelser af interesse; bestemme tilstedeværelsen af ​​receptor typer af farmakologisk målrette receptorer med specifik agonists; bestemme rollen af ​​en receptor med tilstedeværelsen af ​​en eller flere antagonister; eller bestemme potentielle interaktioner af forbindelser af interesse med antagonister. Gennem hele denne, der indsamles data i realtid kan væv opsamlet fra et enkelt dyr udsættes for en lang række forskellige eksperimentelle behandlinger (et in vitro fordel), og repræsenterer vaskulatur på hver side af kapillærbane at give en præcis billede af, hvad der kunne ske i afferente og efferente blodforsyning understøtter tyndtarmen.

Introduction

Ændringer i blodgennemstrømningen til et væv seng kan have en stor indflydelse på organfunktion. En primær funktion af tyndtarmen er næringsstof absorption. Arteriel blodtilførslen til absorberende overflade af tarmen er nødvendig for optagelse af næringsstoffer og blodgennemstrømningen øges for at hjælpe til absorptionen af næringsstoffer som fordøjede bevæger sig langs overfladen ^1. Et fald i blodgennemstrømningen kan forårsage en reduktion i optagelsen af næringsstoffer på grund af et fald i transepithelial gradient ^2. Ud over næringsstoffer, kan tyndtarmen også blive udsat for sekundære metabolitter, narkotika eller toksiner, der udøver en virkning på lokaliseret blodgennemstrømning i mesenterium. I tilfælde af det drøvtyggende dyr, kan forbindelser blive befriet fra et foderstof (f.eks næringsstoffer, såsom aminosyrer, eller toksiner, såsom ergotalkaloider) gennem gæringsprocesser af formave. Hvis disse forbindelser overlever den mikrobielle metabolisme af ruminal fermentering, er de nu tilgængelige for absorptioneller interaktion som de bevæger sig gennem mave-tarmkanalen i dyret.

Der er en række forskellige metoder til rådighed til at måle blodgennemstrømning in vivo (f.eks Doppler ultralyd, iboende blod flowmetre, radiomærkede mikrokugler og indikator-fortynding teknikker), der tillader evaluering af forskellige eksperimentelle scenarier eller behandlinger. Men for at indhente oplysninger om de mekaniske eller farmakologiske egenskaber af vaskulær glat muskulatur, metoder fortsat begrænset til store skibe, indtil Mulvany og Halpern ³ offentliggjorde en artikel, der beskriver en teknik med anvendelse ledning monteret ring præparater vaskulære i en myograph. Da udviklingen af ​​denne teknik, fortsat gøres til de tilknyttede myograph systemer, der tillader en række forskellige applikationer til evaluering af rørformede strukturer modifikationer. Systemet er også blevet indrettet til at anvende faste stænger til montering større skibe ^{4 Såfremt} perfusionteknikker er ikke ønsket.

På grund af uoverensstemmelser mellem fartøjer fra forskellige anatomiske oprindelser og udmærkelser i samme fartøjer fra forskellige arter af dyr, data fra fartøjet, og dyreart ikke let kan ekstrapoleres på tværs af forskellige fartøjer eller det samme fartøj i forskellige dyr typer ^5. Derfor skal særskilte bioassays blive udviklet og valideret når som helst disse aspekter ændres. For nylig flere bioassays er udviklet med disse teknologier til brug i kvæg laterale saphenavene og højre vom arterie og vene ^6,7.

Dette bioassay er udviklet til specifikt at undersøge de virkninger, ergotalkaloider har på vaskulaturen støtte tyndtarmen. Det blev rapporteret, at 50-60% af fodret alkaloider vises i løbemaveforskydning indhold, men kun 5% nyttiggøres i fæces ^8. Strickland et al. ⁹ anført i en gennemgang af meldrøjealkaloider, at de foreliggende data Suggest, at tyndtarmen kan være det vigtigste sted for ergopeptine absorption. Eckert et al. ¹⁰ anmeldt biofarmaceutiske aspekter af sekalealkaloider og erklærede, at når de krydser epitelbarrieren er ergotalkaloiderne transporteres enten af lymfesystemet til nøglebensvenen eller via mesenterial venen og ind i portalen blod. Rhodes et al. ¹¹ rapporteret et fald i blodtilførslen til duodenum og colon i stude indtager en høj endofytinficerede (høj ergotalkaloid) kost. Bruger den rigtige ruminal arterie og vene bioassay Foote et al. ¹² viste, at ergotalkaloider er vasoaktive i vommen vaskulatur. Foote et al. ^13. efterfølgende påvist in vivo, at ruminal eksponering for ergot alkaloider resulterer i en nedsat vommen epitel blodgennemstrømning. Dette fald i blodtilførslen til den absorberende overflade af vommen samtidig forårsagede en reduktion i næringsstof (flygtig fedtsyre) flux. Da quantity af meldrøjealkaloider passerer videre til tyndtarmen fra formave; Hypotesen var, at der vil forekomme en tilsvarende virkning på tyndtarmen karsystem og optagelse af næringsstoffer. Dette nødvendiggjorde udviklingen af ​​kvæg proximale ileum mesenteriske arterie og vene bioassay.

Protocol

Procedurer, der anvendes i denne undersøgelse ikke kræver godkendelse fra University of Kentucky Animal Care og brug Udvalg fordi levende dyr blev anvendt. Forud for indsamlingen af ​​enhver prøve anvendt heri blev alle dyr bedøves med en boltpistol og tømt for blod. Dette blev udført ved en føderalt inspiceret slagteri facilitet på University of Kentucky. En officiel repræsentant for USDA Fødevaresikkerhed og Inspection Service overholdt alle aktiviteter, der behandles med det levende dyr og håndtering a…

Representative Results

Blodkarrene bruges til at generere de inkluderede resultater blev indsamlet fra 6 holstenske stude (425 ± 8 kg) inden for en 3 ugers interval. Et eksempel på en typisk mesenteriske vene kontraktile reaktion på KCI og behandling tilføjelser stigende koncentration er vist i figur 2. Reaktionsgraden vil variere noget med størrelsen af beholderen (korreleret med størrelsen af donor dyr), men kan også blive påvirket (negativt) ved forkert håndtering (strækning) af skibene under indsamling og rengø…

Discussion

Den første udfordring i udviklingen af ​​dette bioassay var etableringen af ​​en gentagelig indsamlingssted for mesenterisk kar. Prøvested konsistens er kritisk, da nogle af de funktioner i tyndtarmen ændres under progression fra jejunum gennem ileum og dermed mesenterium varierer i et lignende mønster. Ileal grene af mesenterialarterie og vene var den mest let identificeres gennem anatomiske vartegn. Ved at placere coecum og efter ileocecal fold til sin endestation på venstre side af mesenteriet, er nær a…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comment/Description (optional)
Multi Myograph	Danish Myo Technologies	610M	A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.
Powerlab 8/sp	ADIntruments	ML785
LabChart 7	ADInstruments	Version 7
Force Calibration Kit	Danish Myo Technologies	100055	Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter	Nalgene	595-4520	0.22 um pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps	Miltex	555008FT	Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors	Miltex	18-1510	Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope	Zeiss	Stemi 2000-C	Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice	Braintree Scientific	TM C12	This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer	Sigma-Aldrich	K3753-10x1L	It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate	Sigma-Aldrich	C7902-500G
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Desipramine-HCl	Sigma-Aldrich	D3900-5G
Propranolol-HCl	Sigma-Aldrich	P0884-1G
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
95% O2/5% CO2	Scott Gross	UN3156