Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים
Summary
Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.
Abstract
פירוק חלבונים על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום (UPS) הוא מנגנון רגולציה עיקרי להומאוסטזיס חלבון בכל אאוקריוטים. הגישה סטנדרטית לקביעת פירוק חלבונים תאיים מסתמכת על מבחני ביוכימיים לבעקבות קינטיקה של ירידת חלבון. שיטות כאלה הן לעתים קרובות מייגע וגוזלים זמן ולכן לא ניתן לניסויים שמטרתם להעריך את מצעים מרובים ותנאי השפלה. כחלופה, מבחני מבוססי צמיחת תאים פותחו, שהם, בפורמט קונבנציונלי, מבחני נקודת סיום שלהם שלא ניתן לקבוע כמותית שינויים יחסי ברמות חלבון.
כאן אנו מתארים שיטה שבנאמנות קובעת שינויים בשערי פירוק חלבונים על ידי צימודם לקינטיקה תא צמיחת שמרים. השיטה מבוססת על מערכת בחירה הוקמה בי auxotrophy אורציל של URA3 -deleted תאי שמרים הוא חולץ על ידי חלבון כתב הביע באופן אקסוגני, מורכב מהיתוך בין גן URA3 החיוני ומכריע השפלה (degron). חלבון הכתב מתוכנן כך ששיעור הסינתזה שלה הוא קבוע בזמן שקצב הפירוק שלה נקבע על ידי degron. כצמיחת תאים במדיום אורציל הלקוי היא פרופורציונלית לרמות היחסית של URA3, קינטיקה הצמיחה הן תלויה לחלוטין בפירוק חלבוני כתב.
שיטה זו מדויקת מודדת שינויים בקינטיקה פירוק חלבונים תוך-התאית. זה היה מוחל על: (א) הערכת התרומה היחסית של גורמי conjugating היוביקוויטין ידועים proteolysis (ב) E2 מבנה-תפקוד אנזים conjugating מנתח (ג) זיהוי ואפיון של degrons רומן. יישום של המערכת מבוססת URA3 degron- מתעלה תחום פירוק החלבונים, כפי שהוא יכול גם להיות מותאם לשינויי ניטור של רמות חלבון הקשורים לפונקציות של מסלולים סלולריים אחרים.
Introduction
מערכת השפלה יוביקוויטין-פרוטאזום היא מכונה רגולטורים גדולה, שהיה מעורבת בשמירה על הומאוסטזיס חלבון בכל אאוקריוטים. UPS תחילה conjugates מולקולות יוביקוויטין מרובים לחלבון מטרה לאחר שחלבון פולי-יוביקוויטין מתויג הוא מושפל על ידי הפרוטאזום 26s. ברוב המקרים, שיעור הגבלת צעד להשפלת יוביקוויטין תיווך הוא ubiquitylation מצע, בתיווכו של E2 ו- E3 conjugating אנזימי ligating אנזימים (Ligases E3) 1. כתוצאה מכך, יציבות תאית של חלבונים ספציפיים משקפת את הרגישות שלהם ליוביקוויטין-נטיה ואת הפעילות של אנזימי ubiquitylation המקור שלהם.
ligases E3 הם מרכיבי הכרת המצע העיקריים של UPS. ככזה, אנזימים אלה להכיר degrons בתוך מצעים שלהם, כי הם קיימים או לא נחשפו בעמיתים שלהם יציבים 2. לדוגמא, רגולטורים רבים של מ 'מחזור התאיוסט להיות מסונתז ומושפל באופן באופן זמני ספציפי על מנת לשמור על התקדמות מחזור התא כדי. הפירוק של חלבונים אלה נשלט בדרך כלל על ידי זרחון, בתיווכו של קינאז המוסדר איתות התא 3,4. מצד השני, מוכרים חלבונים מקופלים aberrantly דרך degrons הנסתר. אלה הם אזורים שהם בדרך כלל חבויים במבנה היליד ונחשפים על ההפרעות מבנה. degrons אלו כולל תחומים הידרופובי 5-7 ומגזרים במהות סדר 8.
מאז גילוי הזרע של יוביקוויטין-המערכת לפירוק חלבונים ואפיון של עקרונות היסוד שלה בlysates reticulocyte 9, שמרי גנטיקה סייעה בגילוי רב של הרכיבים במערכת היוביקוויטין 10. ההצלחה של שמרי כאורגניזם מודל לניתוח שיטתי של פירוק חלבונים על ידי UPS היא בעיקר בשל העובדה כי UPS היא גבוההly נשמרים בכל אאוקריוטים 4, בשילוב עם amenability כמערכת ניסיונית. ואכן, מערכות המבוססים על שמרים בדרך מועסקות לפענח את מנגנוני פעולה של מכונות ubiquitylation.
לומד פירוק חלבונים באמצעות יוכימיים בדרך כלל דורש הכנת תמציות תא. בעוד ניתן לחלץ חלבוני תא חי בתנאים מתונים יחסית השומרים על אינטראקציות חלבון ותפקוד, הנוכחות של דופן תא חזקה בשמרים 11 דורשת תנאי הפרעה להחמרה ניכרת שבעלולים להשפיע על התאוששות חלבון. ואכן, הליכים שונים להפרעת תא שמרים להשתנות במידה ניכרת ביכולתם לשחזר את החלבונים שלמים בסכומים שבצורה נכונה לייצג השפע הסלולרי היחסי שלהם. אי דיוק נוסף טמון בשיטות השונות מועסקות לקביעת תעריפי פירוק של חלבונים ספציפיים: ניסויי מטבוליות המבוסס על תיוג "דופק מרדף" אחרי immunoprecipitation, כדי לבודד חלבונים ספציפיים 12, הוא לעתים קרובות לא כמותי בקפדנות. לכן, כאשר פירוק חלבונים בהשוואה בשיטה זו, זהירות צריכה להיות למימוש בלפרש את התוצאות. כדי לעקוף את זה חסרון, יכול להיות מועסק assay מרדף cycloheximide חלופי (CHX) 12. ב assay זה, מעכב התרגום יתווסף לתרביות תאים ושינויים זמניים ברמות מצב יציב חלבון נמצאים במעקב בהמשך. עם זאת, השימוש בCHX מוגבל לחלבונים עם מחצית חיים קצרים יחסית (<90 דקות), כמו עיכוב ארוך טווח של סינתזת חלבון הוא רעיל לתאים. יש לציין, שניהם מבחני הנ"ל דורשים שימוש בנוגדנים ספציפי לחלבון, שאינם תמיד זמינים.
כדי להתגבר על מגבלות טכניות אלה, חוקרים פיתחו כמה גישות שאינם דורשים מיצוי תא וטיפול חלבון ישיר. גישה אחת מבוססת על הקמת כן auxotrophicזני st, שהושגו על ידי המחיקה של גני המקודדים אנזימים מטבוליים חיוניים. גנים אלה כוללים HIS3, LEU2, LYS2 וTRP1, קידוד לאנזימים דרושים לסינתזה של חומצות אמינו, כמו גם URA3 שמקודד decarboxylase OMP (URA3), אנזים חיוני של סינתזת ribonucleotide פירימידין. URA3 כבר בשימוש נרחב במחקרי פירוק חלבונים. במבחנים אלה, ביטוי מכונן של URA3 מציל צמיחה של תאי URA3 במדיום אורציל לקוי 13. כתוצאה מכך, ערעור יציבות URA3 באמצעות השילוב של degron יכולה להפחית צמיחת תאים באורציל הבינוני חסר המינימלי. שיטה זו נעשתה שימוש במחקרי פירוק חלבונים שונים, כוללים זיהוי של השפלה גורמי 5, E3 ligases 14 וubiquitylation עזר גורמי 15 וגילוי degrons UPS רומן 16. כל השיטות האלה מועסקות צמיחת תאים על צלחות אגר כקריאת assay. עם זאת, לאהוא קריטריון צמיחה (צמיחה חיובית / שלילית), ואילו חזק ויעיל, הוא בעיקר איכותי ואינו מספק מידע כמותי שהוא חשוב להערכת העוצמה של degron או את תרומתו היחסית של גורמי השפלה עזר שונים.
לכן פיתחנו ומנוצלים וקטורי שמרים ושיטות הקרנה המאפשרים ניתוח שיטתי וכמותית של פירוק חלבונים על ידי URA3 -degron מערכת היתוך. הפרוטוקול מבוסס על assay-לידית קלה המודד קינטיקה צמיחה בתרבות נוזלית בתנאי סלקטיבי (GiLS) ועל הדור של עקומות גדילה סטנדרטית. קינטיקה צמיחת שמרים מתאפיינות בשלושה שלבים עיקריים – הפיגור, מעריכי (יומן) ושלב הנייח. חישוב קינטיקה שמרי שכפול בשלב היומן בתנאים סלקטיבית, אשר נקבע על ידי רמות ביטוי של URA3-degron, מספק o מדידת כמותית בלתי משוחדתפירוק חלבונים ו. שיטה זו יכולה להיות מיושמת למדידה והשוואה של שיעורי השפלה של מצעי UPS המרובים בו זמנית במספר רב של זנים ובתנאים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים assay המבוסס על צמיחת תאים לקביעת תעריפי פירוק חלבונים יחסית, המכונה "קינטיקה צמיחה בתרבות נוזלית בתנאי סלקטיבי '(GiLS). יש assay GiLS מספר יתרונות: זה פשוט להגדיר, רכישת נתונים וניתוח הוא פשוט וזה מאוד מודולרי. כתוצאה מכך, יכול להיות מיושם GiLS בו-זמנית לדוגמא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma – Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma – Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma – Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma – Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96 well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma – Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. 유전학. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
