Reporter-baserte vekstanalyse for systematisk analyse av protein degradering
Summary
Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.
Abstract
Protein degradering av ubiquitin-proteasom system (UPS) er en viktig reguleringsmekanisme for protein homeostase i alle eukaryoter. Standardmetoden for bestemmelse av intracellulær proteinnedbrytingen er avhengig av biokjemiske analyser for å følge kinetikken til protein nedgang. Slike fremgangsmåter er ofte arbeidskrevende og tidkrevende og derfor ikke mottagelig for eksperimenter med sikte på å vurdere flere substrater og degraderingsbetingelser. Som et alternativ, har cellevekst-baserte assays blitt utviklet, som er, i deres konvensjonelle format, end-point-analyser som ikke kan kvantitativt bestemme relative endringer i proteinnivåer.
Her beskriver vi en metode som trofast bestemmer endringer i proteinnedbrytningshastigheter ved å koble dem til gjærcelle-vekstkinetikk. Metoden er basert på en etablert seleksjonssystem hvor uracil auxotrofi av URA3 -deleted gjærceller blir reddet av en eksogent uttrykt rapportørprotein, Som består av en fusjon mellom de essensielle URA3 genet og en degradering determinant (degron). Rapportørprotein er utformet slik at dens syntesehastighet er konstant mens dens nedbrytningshastigheten er bestemt av degron. Som cellevekst i uracil-manglende medium er proporsjonal med de relative nivåer av URA3, vekstkinetikk er helt avhengig av rapportørprotein nedbrytning.
Denne metoden måler nøyaktig endringer i intracellulære protein nedbrytningskinetikk. Det ble påført på: (a) Å vurdere den relative bidraget av kjente ubiquitin-faktorer for å konjugere proteolyse (b) å konjugere enzym E2 struktur-funksjonsanalyser (c) Identifisering og karakterisering av nye degrons. Anvendelse av degron- URA3-basert system overskrider den proteindegradering feltet, som det kan også være innrettet til å overvåke endringer av proteinnivåer forbundet med funksjoner av andre cellulære veier.
Introduction
Den ubikvitin-proteasom-nedbrytning systemet er en viktig regulerende maskin, som har vært implisert i opprettholdelsen av protein homeostase i alle eukaryotes. UPS utgangspunktet konjugater flere ubiquitin molekyler til en målprotein etter poly-ubiquitin-tagget protein forringes av 26S proteasomet. I de fleste tilfeller er det hastighetsbegrensende trinnet for ubiquitin-formidlet nedbrytning substrat ubiquitylation, mediert av E2 og E3 konjugere enzymer ligering av enzymer (E3-ligaser) 1. Følgelig intracellulære stabiliteten av spesifikke proteiner gjenspeiler deres følsomhet overfor ubiquitin-konjugering og aktiviteten av deres ubiquitylation beslektede enzymer.
E3 ligaser er de viktigste underlaget anerkjennelse komponenter av UPS. Som sådan, disse enzymene gjenkjenner degrons innenfor sine substrater som enten er fraværende eller ikke eksponert i sine stabile kolleger to. For eksempel, mange regulatorer av cellesyklusen must bli syntetisert og nedbrutt i en tidsmessig bestemt måte for å holde cellesyklusprogresjon i rekkefølge. Nedbrytningen av disse proteinene er ofte styrt ved fosforylering, mediert av celle-signal regulerte kinaser 3,4. På den annen side, er abnormt-foldede proteiner anerkjent gjennom kryptiske degrons. Dette er områder som normalt er skjult i den innfødte struktur og er utsatt på struktur forstyrrelse. Slike degrons inkluderer hydrofobe domener 5-7 og egentlig uordnede segmenter 8.
Siden seminal oppdagelsen av ubiquitin-system for proteinnedbrytning og karakterisering av dens grunnprinsipper i retikulocytt-lysater 9, gjær genetikk var medvirkende i å oppdage mange av komponentene i systemet 10 ubiquitin. Suksessen av gjær som et modellorganisme for systematisk analyse av proteindegradering av UPS er hovedsakelig på grunn av det faktum at UPS er høyly konservert i alle eukaryoter 4, kombinert med deres amenability som en eksperimentell system. Faktisk er gjær-baserte systemer som vanligvis benyttes til å dechiffrere de virkningsmekanismer av ubiquitylation maskiner.
Studerer protein nedbrytning av biokjemiske midler vanligvis krever forberedelse av celleekstrakter. Mens animalsk celleproteiner kan ekstraheres under relativt milde betingelser som bevarer proteininteraksjoner og funksjon, nærværet av en robust cellevegg i gjær 11 krever betydelig strengere avbrudd betingelser som kan påvirke proteingjenvinning. Faktisk forskjellige fremgangsmåter for gjær celleoppbrytning varierer betraktelig i deres evne til å gjenopprette intakte proteiner i mengder som korrekt representerer deres relative celle overflod. Videre unøyaktighet er iboende i de ulike metoder som benyttes for å bestemme nedbrytningshastigheter av spesifikke proteiner: Metabolsk merking baserte 'puls-chase' eksperimenter fulgt av imimmunoutfelling, for å isolere spesifikke proteiner 12, er ofte ikke strengt kvantitativt. Så når protein nedbrytning sammenlignes med denne metoden, ekstra forsiktighet bør utvises i å tolke resultatene. For å omgå denne ulempen, kan en alternativ cykloheksimid (CHX) chase analysen være ansatt 12. I denne analysen blir oversettelses inhibitor tilsatt til cellekulturer og temporale endringer i protein steady-state nivået blir deretter overvåket. Ikke desto mindre er bruken av CHX begrenset til proteiner med forholdsvis korte halveringstider (<90 min), så langvarig inhibering av proteinsyntesen er cytotoksisk. Spesielt, begge av de ovennevnte analyser som krever bruk av protein-spesifikke antistoffer, som ikke alltid er tilgjengelig.
For å overvinne disse tekniske begrensninger, har forskere utviklet flere metoder som ikke krever celle utvinning og direkte protein håndtering. En tilnærming er basert på etablering av auxotrof jast-stammer, fremstilt ved sletting av gener som koder for viktige metabolske enzymer. Slike gener inkluderer HIS3, LEU2, LYS2 og TRP1, som koder for enzymene som kreves for aminosyre-biosyntese, så vel som URA3 som koder OMP-dekarboksylase (URA3), et essensielt enzym for biosyntesen pyrimidin ribonukleotid. Ura3 har vært mye brukt i protein-nedbrytningsstudier. I disse analysene, konstituerende uttrykk for ura3 redder veksten av ura3 celler i uracil-mangel medium 13. Følgelig kan destabilisere URA3 gjennom fusjonen av en degron redusere celleveksten på minimal-medium som mangler uracil. Denne metoden har vært brukt i ulike protein nedbrytningsstudier, inkludert identifisering av nedbrytning determinanter 5, ligaser E3 14 og hjelpe ubiquitylation faktorer 15 og oppdagelsen av nye UPS degrons 16. Alle disse fremgangsmåter anvendes cellevekst på agarplater som assay avlesning. Imidlertid tHan vekst kriterium (positiv / negativ vekst), mens robust og effektiv, er det meste kvalitativ og gir ikke kvantitativ informasjon som er viktig for å vurdere en degron potens eller den relative bidraget av ulike hjelpenedbrytningsfaktorer.
Vi har derfor utviklet og utnyttet gjærvektorer og screeningmetoder som gjør det mulig systematisk og kvantitativ analyse av proteindegradering av URA3 -degron fusion system. Protokollen er basert på en lett-å-håndtak assay som måler vekstkinetikk i flytende kultur under selektive betingelser (GILS) og på generering av standard vekstkurver. Gjærvekstkinetikken er karakterisert av tre hovedfaser – etterslepet, den eksponensielle (log) og den stasjonære fasen. Beregning av gjær replikering kinetikk under logfase under selektive betingelser, som bestemmes av nivåer av uttrykk for URA3-degron, gir en upartisk kvantitativ måling of protein degradering. Denne fremgangsmåten kan anvendes til å måle og sammenligne nedbrytningshastigheter av flere UPS-substrater samtidig i flere stammer og under forskjellige betingelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en analyse basert på cellevekst for å bestemme relative protein nedbrytningshastigheter, kalt 'Vekstkinetikk i flytende kultur under selektive betingelser' (Gils). Den Gils analysen har flere fordeler: Det er enkelt å sette opp, datainnsamling og analyse er grei, og det er ekstremt modulær. Følgelig kan GILS påføres samtidig til flere prøver på en brukervennlig multi-brønn plate-format som kan tilpasses til automatisering for høy gjennomstrømning. Viktigst, gir svært reproduserbare …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma – Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma – Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma – Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma – Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96 well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma – Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. 유전학. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
