Reporter baserade tillväxtanalys för systematisk analys av proteinnedbrytning
Summary
Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.
Abstract
Proteinnedbrytning av ubiquitin-proteasomsystemet (UPS) är en viktig regleringsmekanism för protein homeostas i alla eukaryoter. Standarden metod för att fastställa intracellulär proteinnedbrytning beroende av biokemiska analyser för att följa kinetiken för protein nedgång. Sådana metoder är ofta arbetskrävande och tidskrävande och därför inte kan bli föremål för experiment som syftar till att utvärdera ett flertal substrat och nedbrytningsförhållanden. Som ett alternativ, har celltillväxtbaserade analyser utvecklats, som är i sina vanliga format, end-point-analyser som inte kan kvantitativt bestämma relativa förändringar i proteinnivåer.
Här beskriver vi en metod som troget bestämmer förändringar i proteinnedbrytningshastigheter genom att koppla dem till jästcelltillväxt kinetik. Metoden bygger på en etablerad urvalssystem där uracil auxotrofi av URA3 -deleted jästceller räddas av en exogent uttryckta rapportprotein, Som består av en fusion mellan den essentiella URA3-genen och en determinant nedbrytning (degron). Reporterproteinet är utformat så att dess synteshastighet är konstant medan dess nedbrytningshastighet bestäms av degron. Som celltillväxt i uracil-defekta mediet är proportionellt mot de relativa nivåerna av Ura3, tillväxt kinetik är helt beroende av nedbrytningen reporterproteinet.
Denna metod mäter noggrant förändringar i intracellulära proteinnedbrytnings kinetik. Det användes till: (a) Att bedöma den relativa betydelsen av kända ubiquitin-konjugera faktorer för proteolys (b) E2 konjugera enzym struktur-funktionsanalyser (c) Identifiering och karakterisering av nya degrons. Tillämpning av degron- URA3 -baserad systemet överskrider området proteinnedbrytning, eftersom den också kan anpassas till att följa förändringar av proteinnivåer är associerade med funktioner av andra cellulära reaktionsvägar.
Introduction
Systemet ubiquitin-proteasom nedbrytning är en viktig reglerande maskin, som har varit inblandad i upprätthållande av protein homeostas i alla eukaryoter. UPS konjugat ursprungligen flera ubiquitin molekyler till ett målprotein varefter poly-ubiquitin-märkta proteinet bryts ned av 26S proteasomen. I de flesta fall är det hastighetsbegränsande steget för ubiquitin medierad nedbrytning substrat ubiquitylation, förmedlad av E2 konjugera enzymer och E3 ligering enzymer (E3 Ligaser) 1. Följaktligen intracellulär stabilitet av specifika proteiner återspeglar deras mottaglighet för ubikitin-konjugering och aktiviteten av deras besläktade ubiquitylation enzymer.
E3 ligaser är de huvudsakliga substratigenkännings komponenter i UPS. Som sådana dessa enzymer erkänner degrons inom sina substrat som antingen är frånvarande eller inte exponerat i sina stabila motparter 2. Till exempel har många regulatorer av cellcykeln must syntetiseras och bryts ned på ett temporalt specifikt sätt för att hålla cellcykelprogression i ordning. Nedbrytningen av dessa proteiner är ofta kontrolleras av fosforylering, förmedlad av cellsignalering reglerade kinaser 3,4. Å andra sidan, är felaktigt över veckade proteiner erkännas genom kryptiska degrons. Detta är regioner som normalt är dolda i det ursprungliga strukturen och är utsatta på strukturen störning. Sådana degrons innefattar hydrofoba domäner 5-7 och i sig störda segment 8.
Eftersom det nyskapande upptäckten av ubiquitin-system för proteinnedbrytning och karakterisering av dess grunder i retikulocyt lysat 9, jästgenomiken bidrog upptäcka många av komponenterna i ubiquitin systemet 10. Framgången med jäst som modellorganism för systematisk analys av proteinnedbrytning av UPS beror främst på det faktum att UPS är högly konserverade i alla eukaryoter 4, i kombination med deras mottaglighet som ett experimentellt system. I själva verket är jästbaserade system som vanligtvis används för att dechiffrera mekanismerna för verkan av ubiquitylation maskiner.
Studera proteinnedbrytning genom biokemiska metoder kräver oftast beredning av cellextrakt. Medan djurcellproteiner kan utvinnas under relativt milda betingelser som bevarar protein interaktioner och funktion, förekomsten av en robust cellvägg i jäst 11 kräver betydligt hårdare störningsförhållanden som kan påverka proteinutvinning. Faktum är olika förfaranden för cellstörningar jäst varierar avsevärt i deras förmåga att återhämta sig intakta proteiner i mängder som korrekt representerar deras relativa cellulära överflöd. Ytterligare felaktighet är inneboende i de olika metoder som används för att bestämma nedbrytningshastigheten av specifika proteiner: Metabola märkning baserade "puls-chase" experiment följt av immunoprecipitation, för att isolera specifika proteiner 12 är ofta inte strikt kvantitativa. Så när proteinnedbrytning jämförs med denna metod, extra försiktighet bör iakttas vid tolkning av resultaten. För att kringgå denna nackdel, kan en alternativ cykloheximid (CHX) chase-analysen användas 12. I denna analys är översättningen inhibitor sattes till cellkulturer och tidsmässiga förändringar i protein steady state-nivåerna därefter övervakas. Ändå är användningen av CHX begränsad till proteiner med relativt korta halveringstider (<90 min), så långsiktig hämning av proteinsyntesen är cytotoxiskt. Noterbart är båda av de ovan nämnda analyser kräver användning av proteinspecifika antikroppar, som inte alltid är tillgängliga.
För att övervinna dessa tekniska begränsningar, har forskare utvecklat flera metoder som inte kräver cell utvinning och direkt hantering protein. Ett tillvägagångssätt är baserat på inrättandet av auxotrof jast stammar, erhållna genom strykningen av gener som kodar för viktiga metaboliska enzymer. Sådana gener inkluderar HIS3, LEU2, LYS2 och TRP1, kodning för enzymer som krävs för biosyntes aminosyra, samt URA3 som kodar OMP dekarboxylas (Ura3), ett viktigt enzym i pyrimidin ribonukleotid biosyntes. Ura3 har använts i stor utsträckning proteinnedbrytningsstudier. I dessa analyser, konstitutivt uttryck av Ura3 räddar tillväxten av URA3-celler i uracil-defekta mediet 13. Följaktligen kan destabilisera Ura3 genom fusion av en degron minska celltillväxt på minimalt medium som saknar uracil. Denna metod har använts i olika proteinnedbrytningsstudier, inklusive identifiering av nedbrytningsbestämningsfaktorer 5, ligas E3 14 och hjälp ubiquitylation faktorer 15 och upptäckten av nya UPS degrons 16. Alla dessa metoder som används celltillväxt på agarplattor som analys utläsning. Emellertid tHan tillväxtkriterium (positiv / negativ tillväxt), medan robusta och effektiva, är mestadels kvalitativ och inte ger kvantitativ information som är viktig för att utvärdera ett degron potens eller den relativa betydelsen av olika hjälpnedbrytningsfaktorer.
Vi har därför utvecklat och utnyttjat jästvektorer och screeningmetoder som möjliggör en systematisk och kvantitativ analys av proteinnedbrytning av URA3 -degron fusionssystemet. Protokollet är baserat på en enkel-till-handtaget analys som mäter Tillväxt kinetik i flytande odling under selektiva betingelser (GILS) och på generering av standardtillväxtkurvor. Jäst tillväxt kinetik kännetecknas av tre huvudfaser – eftersläpning, den exponentiella (log) och den stationära fasen. Beräkning av jästreplikerings kinetik under log-fasen under selektiva betingelser, som bestäms av nivåerna av uttryckning av URA3-degron, ger en objektiv kvantitativ mätning of proteinnedbrytning. Denna metod kan tillämpas på att mäta och jämföra nedbrytningshastigheter på flera UPS-substrat samtidigt i flera stammar och under olika förhållanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en analys baserad på celltillväxt för bestämning av relativa protein nedbrytningshastigheter, benämnda "Tillväxt kinetik i flytande odling under selektiva betingelser '(GILS). Den Gils-analysen har flera fördelar: Det är enkelt att sätta upp, datainsamling och analys är enkel och det är extremt modulärt. Följaktligen kan GILS anbringas samtidigt på flera prov på ett användarvänligt flerbrunnsplattformat som kan anpassas till automatisering för hög genomströmning applikation…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma – Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma – Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma – Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma – Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96 well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma – Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. 유전학. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
