תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס
Summary
פרוטוקול לתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס, המאפשר לשחזר היבטים רבים של פגיעה המוחית איסכמי, מוצג. על ידי לימוד לשינויים בתאי עצב שינויים של neurovasculature בנוסף, פרוטוקול זה הוא כלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה.
Abstract
פגיעה המוחית איסכמי היא בין המצבים השכיחים וההרסניים ביותר להתפשר תפקוד מוח תקין, ולעתים קרובות מובילה למתמידים ליקויים תפקודיים בחולים שנפגעו. למרות מאמצי מחקר אינטנסיביים, עדיין אין אפשרות טיפול יעילה זמינה המפחיתה את פגיעה עצבית ומגנה על תאי עצב באזורי איסכמי ממוות שני מעוכב. מחקר בתחום זה בדרך כלל כרוך בשימוש במודלים של בעלי חיים מורכבים ובעייתיים. תרבויות הפרוסה organotypic Entorhino-היפוקמפוס תיגר עם חמצן וקיפוח גלוקוז (OGD) הוקמו במודלים חוץ גופית המחקים איסכמיה מוחית. ההיבט החדשני של מחקר זה הוא ששינויים של כלי דם במוח נלמדים בנוסף לשינויים עצביים ואת התגובה של שניהם תא העצבי וכלי דם התא ניתן להשוות ומתואם. השיטות שהוצגו בפרוטוקול זה באופן משמעותי להרחיב את היישומים הפוטנציאליים של אוגישת התרבות הפרוסה ganotypic. האינדוקציה של OGD או היפוקסיה לבדו יכולה להיות מיושמת על ידי ולא פשוטים בתרבויות פרוסה organotypic ומובילה לנזק לאמין לשחזור ברקמה העצבית. זאת בניגוד מוחלט לניסויים בבעלי החיים מסובכים ובעייתיים גרימת שבץ ואיסכמיה in vivo. על ידי הרחבת הניתוח לכולל את חקר התגובה של כלי הדם יכול לספק דרכים חדשות על איך לשמר ולשחזר תפקודי מוח. גישת התרבות הפרוסה המוצגת כאן עשויה להתפתח לכלי אטרקטיבי וחשוב למחקר של פגיעה המוחית איסכמי ועשויה להיות שימושי לבדיקת אמצעים טיפוליים פוטנציאליים שנועדו neuroprotection.
Introduction
מערכת העצבים המרכזית היא רגישה במיוחד לאובדן או הפחתה של חמצן ואספקת הגלוקוז על ידי מערכת כלי הדם. אפילו הפרעה קצרה ולא של אספקת דם למוח יכולה לגרום לאובדן קבוע של תפקוד של אזורי המוח הרלוונטיים מובילים לתסמונות שבץ טיפוסיות. בנוסף לאובדן העצבי באזורים שנפגעו העיקריים, יש בדרך כלל הוא אובדן עצבי המאוחר נוסף באמצעות נזק המשני. לרוע המזל עד עכשיו, אין טיפול נוירו להפחתת מוות עצבי המשני היה זמין 1. מאמצי מחקר לחקר המנגנונים של נזק משני מסתמכים על השימוש במודלים של בעלי החיים של איסכמיה המוחית כמו עורקים התיכון ספיגה מוחין וטכניקות שונות טרומבוטיים חסימה (לסקירה האחרונה לראות 2). במקביל, גם בשל מגבלות וחששות אתיים עם השימוש במודלים של בעלי חיים, התרבות הפרוסה organotypic של רקמות CNS השונות היה בשימוש המאפשר סטהdy של תגובות עצביות לסוג שונים של פציעות 3-5.
ללימוד התגובה העצבית בתנאים המחקים פגיעה מוחית איסכמי, מערכת המודל של חסך גלוקוז החמצן (OGD) פותחה. במודל זה, תרבויות פרוסה באופן זמני נחשפו למדיום שחסר גלוקוז וכבר equilibrated עם גז חנקן בהיעדר החמצן. עם טיפול כזה, ניתן לגרום לפגיעה עצבית ואובדן שהוא די דומה לזה שנצפה לאחר פגיעת איסכמית in vivo 6, 7. בהיפוקמפוס, טיפול כזה גורם לאיבוד עצבי במיוחד בCA1, אך לא ב אזור CA3 או gyrus המשונן של ההיפוקמפוס. בניגוד לכך, המחקר של תגובות של כלי דם בתרבויות פרוסה עד כה לא בוצע באופן נרחב. סיבה ברורה היא חוסר זרימת הדם וזלוף כלי דם במודל התרבות הפרוסה. עם זאת, יש לנו הראינו בעבר כי ניתן לשמור בכלי lood במערכת העצבים המרכזית פורסים תרבויות במשך כמה ימים 8, 9.
המטרה הכללית של שיטה זו היא לפקח לא רק את גורלם של תאי עצב לאחר OGD אבל להאריך את המחקר לגורל והשיפוץ של כלי הדם שהוא חלק חשוב מהתגובה לפציעה. עד כה מחקרים כאלה דורשים השימוש בניסויים בבעלי חיים (דה יונג et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). בפרוטוקול מובא כאן, אנו פירוט כיצד ניתן לעשות מחקרים כאלה בתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס תיגר גם עם היפוקסיה או על ידי נגעי הפעלת יתר רעילים ואחריו ניתוח של שתי תגובות הישרדות וכלי דם עצביות. פרוטוקול זה מבוסס על מחקר שפורסם בעבר בנושא זה 10 ויכול להיות שימושי עבור כל מעבדה מתעניינת באינטראקציות עצבים וכלי דם במערכת העצבים המרכזית.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם השיטות שהוצגו כאן, ניתן להשתמש בתרבויות פרוסה organotypic היפוקמפוס ככלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה. בעוד תרבויות הפרוסה organotypic היו בשימוש בעבר ללימוד תגובות עצביות לאחר איסכמיה 6, 7 ההיבט החדש של המחקר בו זמני של שינויים בכלי הדם משפר באו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת באזל, המחלקה ליו, והקרן השוויצרית הלאומית למדע (31003A_141007). מרקוס Saxer סיפק תמיכה טכנית.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
References
- Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
- Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia. Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).
- Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors. Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).
- Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase. C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).
- Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).
- Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier. J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).
- Camenzind, R. S., et al. Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier. 신경과학. 170, 361-371 (2010).
- De Jong, G. I., et al. Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment. 신경과학. 91, 203-210 (1999).
- Cavaglia, M., et al. Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia. Brain Res. 910, 81-93 (2001).
- Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
