Analysen av Neurokar ombygging i Entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer

Summary

En protokoll for entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer, som lar reprodusere mange aspekter av iskemisk hjerneskade, blir presentert. Ved å studere forandringer i neurovasculature i tillegg til endringer i neuroner, er denne protokollen et allsidig verktøy for å studere forandringer i plast neural vev etter skade.

Abstract

Iskemisk hjerneskade er blant de vanligste og ødeleggende forhold kompromitterende riktig hjernens funksjon og ofte fører til vedvarende funksjonelle underskudd i de berørte pasientene. Til tross for intensiv forskningsinnsats, er det fortsatt ingen effektiv behandling alternativet tilgjengelig som reduserer nerveskader og beskytter nevroner i de iskemiske områder fra forsinket sekundær død. Forskning på dette området innebærer vanligvis bruk av forseggjorte og problematiske dyremodeller. Entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer utfordret med oksygen og glukose deprivasjon (OGD) er etablert in vitro modeller som etterligner cerebral iskemi. Det nye aspekt ved denne studien er at endringer av hjerneblodårer blir undersøkt i tillegg til neuronal endringer og reaksjonen av både den neuronale rommet og vaskulær rommet kan sammenlignes og korreleres. Metodene som presenteres i denne protokollen vesentlig utvide de potensielle anvendelser av ellerganotypic skive kultur tilnærming. Induksjonen av OGD eller hypoksi alene kan påføres med ganske enkle midler i organotypic skive kulturer og fører til pålitelig og reproduserbar skade på nervevevet. Dette står i sterk kontrast til de kompliserte og problematiske dyreforsøk som induserer slag og iskemi in vivo. Ved å utvide analyse å inneholde studiet av reaksjonen av vaskulaturen kan gi nye måter å opprettholde og gjenopprette hjernefunksjoner. Stykket kultur tilnærming som presenteres her kan utvikle seg til en attraktiv og viktig verktøy for studiet av iskemisk hjerneskade og kan være nyttig for å teste potensielle terapeutiske tiltak rettet mot nevro.

Introduction

Det sentrale nervesystem er spesielt følsomme for tap eller reduksjon av oksygen og glukose tilførsel av vaskulaturen. Selv en relativt kort avbrudd av blodtilførsel til hjernen, kan indusere et permanent tap av funksjon av de relevante områder av hjernen som fører til de typiske slagsyndromer. I tillegg til den neuronale tap i primær berørte områdene, er det vanligvis mer forsinket neuronal tap gjennom sekundære skader. Dessverre finnes det inntil nå ikke neurobeskyttende behandling for reduksjon av sekundær neuronal død var tilgjengelig ^en. Forskningsinnsats for å studere mekanismene for sekundære skader stole på bruk av dyremodeller av cerebral iskemi som midten cerebral arterie okklusjon og ulike trombotisk okklusjon teknikker (for en fersk gjennomgang se ^2). Parallelt, også på grunn av begrensninger og etiske problemer med bruk av dyremodeller, organotypic skive kultur av forskjellige CNS-vev har blitt brukt som tillater study nevrale reaksjoner på ulike type skader ^3-5.

For å studere den neuronale reaksjonen under betingelser som etterligner iskemisk hjerneskade, har modellsystem av oksygen glukosemangel (OGD) blitt utviklet. I denne modellen blir skive kulturer midlertidig utsettes for et medium som mangler glukose og har blitt ekvilibrert med nitrogengass i fravær av oksygen. Med en slik behandling, er det mulig å indusere neuronal skade og tap som er ganske lik den som ble observert etter iskemisk skade in vivo ^{6, 7.} I hippocampus, induserer en slik behandling nevronale tap spesielt i CA1, men ikke i CA3 området eller dentate gyrus av hippocampus. I kontrast, studiet av vaskulære reaksjoner i skive kulturer så langt ikke har vært mye foretatt. En åpenbar årsak er mangelen på sirkulasjon og blodårer perfusjon i stykket kulturmodell. Vi har imidlertid tidligere vist at det er mulig å opprettholde bLood fartøy i CNS skjære kulturer i flere dager ^{8, 9.}

Det overordnede målet med denne metoden er å ikke bare overvåke skjebnen til nevroner etter OGD men utvide studien til skjebnen og ombygging av blodkar som er en viktig del av skaden respons. Inntil nå slike studier har krevd bruk av dyreforsøk (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). I protokollen som presenteres her, vi vil detalj hvordan slike studier kan gjøres i entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer utfordret enten med hypoksi eller ved eksitotoksiske lesjoner etterfulgt av analyse av begge nevronale overlevelse og blodkar reaksjoner. Denne protokollen er basert på en tidligere publisert studie på dette emnet ^10, og kan være nyttig for en hvilken som helst laboratorium interessert i nevrovaskulære interaksjoner i CNS.

Protocol

Dyreforsøk ble utført i samsvar med europeiske fellesskaps rådsdirektiv av 22. september-2010 (2010/63 / EU), og ble anmeldt og tillatt av sveitsiske myndigheter. 1. Sette opp organotypic Entorhino-hippocampus skive kulturer Forbered entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer (EHOSCs) fra postnatal dag 4 (P4) museunger ved hjelp av statisk inkubasjon metoden 4,11. Her bruker C57Bl6 og CB6F1 mus. Ta ca 30 min per mus valp for utarbeidelse av skive kultu…

Representative Results

Oksygen glukosemangel og hypoxia forårsake neuronal død og redusert blodkar spesielt i hippocampus CA1 regionen. OGD eller oksygenmangel alene i 15 min induserte en sterk induksjon av celledød som sett av propidium jodid farging spesielt i CA1 området av hippocampus (Figur 3) tilsvarende som beskrevet tidligere 7.. Med markører for å visualisere nettverket av blodårer, ble det funnet at blodkartettheten og organisasjon først på lik kontroll OGD etter utfordring i de f…

Discussion

Med de fremgangsmåter som er presentert her, kan hippocampus organotypic skive kulturer anvendes som en allsidig verktøy for å studere forandringer i plast neural vev etter skade. Mens organotypic skive kulturer har blitt brukt tidligere for å studere nevrale reaksjoner etter iskemi ^{6, 7} den nye aspekt av den samtidige studie av vaskulære endringer vesentlig bedre de potensielle anvendelser av denne metoden. Induksjonen av OGD eller hypoksi alene kan påføres med ganske enkle midler i organotypic skive …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Minimum Essential Medium MEM	Gibco	11012-044
Glutamax	Gibco	35050-061	stabilized form of L-glutamine
Millicell cell culture inserts	Millipore	PICM03050
Basal medium Eagle	Gibco	41010-026
Horse serum	Gibco	26050-088
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
B27 supplement	Gibco	17504-044
Anaerobic strips	Sigma-Aldrich	59886
Propidium iodide solution	Sigma-Aldrich	P4864
AMPA	R&D systems	0169-10
CNQX	R&D systems	0190/10
TTX	R&D systems	1078/1
polyclonal anti-laminin	Sigma-Aldrich	L9393
anti-MAP2	Abcam	ab11267
Alexa anti mouse 350	Molecular Probes	A11045
Alexa anti mouse 488	Molecular Probes	A11001
Alexa anti rabbit 350	Molecular Probes	A11046
Alexa anti rabbit 488	Molecular Probes	A11008
Statistics software	GraphPad Software	GraphPad Prism
McIlwain tissue chopper	Ted Pella	10180
Hypoxia chamber	Billups-Rothenberg	MIC-101