Metoder for Cell-festet måling av kapasitans i Mouse Adrenal chromaffin Cell

Summary

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

Abstract

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

Introduction

Synaptisk transmisjon er mediert av exocytose av nevrotransmitter-synaptiske vesikler inneholdende, og disse vesikler må gjennomgå lokal endocytic resirkulering innen nerveterminalen til å opprettholde neuronal kommunikasjon på lang sikt. Gitt den essensielle rolle synaptisk transmisjon i hjernen, forståelsen av den molekylære maskineri som utgjør den synaptiske vesikkel syklusen er et vesentlig grunnlag for en bedre forståelse i mobil kommunikasjon som helhet. Blant cellemodellsystemer, har adrenal chromaffin celle gitt noen av de mest definitive innsikt i den molekylære maskiner underliggende synaptisk vesikkel resirkulering. Exocytose, det siste trinnet i nevrotransmitter-frigjøring, er blitt uhyre studert og undersøkt ved bruk av den adrenale kromaffinceller celle ^1,2. Faktisk har de fleste av de molekylære spillere som organisere formasjonen, målretting, dokking, og sammensmelting av sekretoriske granuler blitt identifisert på grunn av anvendelsen av diverse teknikker i kromaffinceller ^en. Videre, ved å tilveiebringe en mulighet for å tillate enkel vesikkel-oppløsning av proteinet maskiner involvert i exocytose, forblir chromaffin en kraftig cellemodell for å ta opp de spørsmål vesikkelfusjon ^3.

Cell-festet kapasitans målingene ble først brukt i å løse enkelt vesikkelfusjon under eksocytose ^tre. Exocytose av vesikler så små som ~ 60 nm i diameter har vist seg å bli detektert av cellemembran adgang målinger med patch clamp teknikk i cellen festet konfigurasjonen ^4-7. Opptak er definert som et mål på hvor lett en krets eller enhet vil tillate en strøm til å flyte; det er den inverse av impedans. Således admittans målinger gi en forståelse av membranen kapasitans. Dette oppnås ved inkorporering av vesikulær membran inn i plasmamembranen; dette innlemmelse avslører endringer i overflatenOmråde ^8. Hver fusing vesikkel fører til en trinnvis økning i membran kapasitans ^9,10. I tillegg gir denne adgang måling membrankonduktans og fusion pore konduktans under en exocytotic hendelse ^tre. Som denne teknikken har gitt et unikt verktøy til å identifisere enkelt-vesikkel kinetikk under eksocytose, har vår lab nylig søkt dette konseptet til å oppdage endocytose av enkelt vesikler ^11,12.

Vår spesiell interesse er clathrin endocytose (CME), som har vært betraktet som en grunnleggende rengjøring komponent i mange celler ¹³ og som hoved vei for synaptisk vesikkel endocytose i nerveterminaler ^14,15. CME er kjent for å være biologisk viktig, men dens kinetikk fortsatt ikke godt forstått på grunn av tekniske begrensninger i overvåking entall endocytiske hendelser. Gitt likheter i exocytic mekanismer mellom kromaffinceller og neuroner ^1, er det plausible at fisjons mekanismer i kromaffinceller kan sannsynligvis gjelde for synaptisk vesikkel endocytose i nerveceller. Cellen-festet kapasitans målinger har vært benyttet til å overvåke enkelt endocytiske hendelser og analysere fisjonskinetikk, som de fleste metoder er i stand til å løse. I våre celle-tilknyttet opptak, er en sinusbølge på 20 kHz lagt oppå holdepotensial, og utgangsstrømmen separeres i membran konduktans i en kanal og membran kapasitans i den annen kanal fra en to-fase lock-in-forsterker ^{16- 18.} Fra de forandringer i membranen konduktans og kapasitans, kan man beregne kinetikken av fisjons porer, noe som sannsynligvis korresponderer med den rørformede membran hals som forbinder internalisert vesikkel til plasmamembranen før vesikkel pinch-off. Kollektivt, denne teknikken gir oss muligheten til å undersøke de regulatoriske mekanismer for vesikkel fisjon under CME.

Protocol

MERK: Hele prosedyren ble gjennomført i samsvar med retningslinjene fra National Institutes of Health, som er godkjent av Animal Care og bruk komité ved University of Illinois i Chicago. 1. Solutions og kultur Media Forberedelser Hold alle løsningene ved -20 ° C i inntil seks måneder. Hold kultur media ved 4 ° C i opptil tre måneder. Forbered 100 ml kulturmedier ved å blande 1 ml penn-strep løsning og 1 ml ITSX (Insulin-Transferrin-Selen-Tilskudd) til 100 ml med…

Representative Results

Den celleviabilitet og kvaliteten på gigaohm tetning er kritisk for å bestemme kvaliteten av de celle-tilknyttet kapasitans opptak. Derfor er det viktig å fremskaffe en effektiv og effektiv cellekultur før elektrofysiologiske opptak, og typiske levedyktige celler er vist i figur 1. Vil Practice og tid være nyttig for å oppnå en gigaohm tetning med høy kvalitet. Hvis man kan tydelig se celle deformasjon når plasteret pipette nærmer cellen som beskrevet i protokollen Trinn 5.3, er det en større…

Discussion

Cell-festet kapasitans målinger kreve flere viktige skritt for å kunne få opptak med høy kvalitet: 1) levedyktige og friske celler fremstilt fra binyrene; 2) PDL belegg av Dekkglass; 3) gigaohm segl formasjon; 4) støynivået til systemet; og 5) fasekorreksjon.

For dyr kirurgi, modifikasjoner kan man potensielt gjøre er å justere den kirurgiske tilnærming som passer best fingerferdighet og for å hindre skader under disseksjon. I tillegg er tilstrekkelig praksis på å finne og fjerne…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100mL
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter-1.5 mm
			Inner diameter 1.10 mm
			Length- 10 cm