Analyse en temps réel de profil métabolique dans Published: November 3, 2014 doi: 10.3791/52026

DOI

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Tuba Bas¹, Leonard H. Augenlicht^1,2

¹Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, ²Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine

Summary

Les petits organites des cryptes intestinales en culture ex vivo de fournir un système de culture de tissu qui récapitule croissance des cryptes charge sur les cellules souches et leur niche. Nous avons établi une méthode pour analyser le profil métabolique en temps réel organites de la crypte de la souris primaire. Nous avons trouvé organites maintenir les propriétés physiologiques définis par leur source.

Abstract

La muqueuse intestinale présente une architecture répétitive organisée en deux structures fondamentales: villosités, faisant saillie dans la lumière intestinale et composées d'entérocytes matures, des cellules caliciformes et des cellules entéro-endocrines; et cryptes, résidant à proximité de la sous-muqueuse et la musculeuse, l'hébergement souches adultes et des cellules progénitrices et des cellules matures de Paneth, ainsi que du stroma et les cellules immunitaires du microenvironnement de la crypte. Jusqu'à ces dernières années, des études in vitro de l'intestin grêle a été limité à des lignées cellulaires dérivées de tumeurs bénignes ou malignes, et ne pas représenter la physiologie de l'épithélium intestinale normale et l'influence du microenvironnement dans lequel ils résident. Ici, nous démontrons une méthode adaptée de Sato et al. (2009) pour la mise en culture primaire organites des cryptes intestinales de souris dérivées de souris C57BL / 6. En outre, nous présentons l'utilisation de cultures organoïdes crypte de doser le profil métabolique crypte en temps réel par mesurement de la consommation de base d'oxygène, le taux de la glycolyse, la production d'ATP et de la capacité respiratoire. Organites conservent les propriétés définies par leur source et conservent les aspects de leur adaptation métabolique réfléchie par la consommation d'oxygène et les taux d'acidification extracellulaire. Études métaboliques en temps réel dans cette crypte organoïde de système de culture sont un outil puissant pour étudier le métabolisme de l'énergie organoïde crypte, et comment elle peut être modulée par des facteurs nutritionnels et pharmacologiques.

Introduction

Le cancer colorectal (CCR) est la troisième cause de décès liés au cancer aux États-Unis. Cancer du côlon sporadique --à-dire celle qui résulte plus tard dans la vie (> 50 ans) et sans facteurs génétiques prédisposant claires - représentent environ 80% de tous les cas, avec une incidence fortement influencée par les habitudes alimentaires à long terme ^1,2. Ces tumeurs présentent un changement métabolique à la dépendance de la glycolyse oxydatif, connu comme l'effet Warburg, qui peut en partie faire des concentrations plus élevées de blocs de construction cellulaires et de l'énergie disponibles (par glutaminolysis) pour permettre et peut-être d'atteindre des taux élevés de prolifération des cellules tumorales ^3-5 . Études sur le cancer du côlon ainsi que d'autres cancers gastro-intestinaux, y compris les petits cancers de l'intestin fournissent des indications importantes sur la cause de la formation de tumeurs. Étudier les différences métaboliques entre les états normaux, pro-tumorigènes et tumorigènes de systèmes d'organes gastro-intestinaux peuvent aider detESILIATION de risque relatif pour le développement de la tumeur ainsi que la détection précoce des néoplasies. De plus, la compréhension de métabolisme bioénergétique impliquant la respiration mitochondriale et la glycolyse donnera un aperçu fondamental dans la façon dont la physiologie cellulaire, le vieillissement et la maladie perturbe l'homéostasie intestinale état. L'utilisation de la technologie bioénergétique de dosage pour l'analyse de flux extracellulaire peut évaluer le taux de respiration mitochondriale et de la glycolyse en même temps dans les cellules en croissance en culture en temps réel ^{de 6,7.}

Jusqu'à récemment, les études in vitro de l'intestin grêle ont été limités à des lignées cellulaires dérivées de tumeurs bénignes ou malignes ^8,9 et ne représentent pas la physiologie de l'épithélium intestinale normale et l'influence du micro-environnement dans lequel elles résident. En 2009, Sato et al. ¹⁰ ex vivo introduit un système de culture à croissance tridimensionnelle (3D) de souris organites épithéliales de l'intestin, ou epithElial «mini-tripes", adapté à des recherches expérimentales, diagnostiques et thérapeutiques ^10,11. En outre, cryptes isolées de souris soumis à restriction calorique maintenir leurs propriétés de croissance modifiées que organites dans ces cultures ^12. Par rapport à des lignées cellulaires transformées, cultures organoïdes crypte peuvent être utilisés pour générer des données physiologiquement pertinents présentant une bien meilleure modèle pour comprendre l'état in vivo.

Nous avons adapté la technologie d'analyse bioénergétique pour doser le métabolisme énergétique des organites des cryptes intestinales. Souris organites de la crypte intestinale ont été cultivées ex vivo de développer les études sur le métabolisme de l'énergie organoïdes crypte présentés. Le taux de consommation d'oxygène (OCR) et le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) des organites cryptes ont été mesurées en l'absence et en présence de deux inhibiteurs différents métaboliques (oligomycine, la roténone) et un transporteur d'ions (carbonyl cyanure p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). L'orga crypteréponse métabolique solénoïde à ces composés chimiques ont été traduit avec succès en changeant ECAR et valeurs OCR.

Études bioénergétiques cellulaires permettent d'élucider les interactions réciproques entre l'état métabolique et le risque de maladie et le phénotype dans le cancer, l'obésité, le diabète, les maladies métaboliques et les maladies mitochondriales et aider méthodes de dépistage à l'avance avec des implications directes pour la médecine translationnelle. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour isoler petites cryptes intestinales et à la culture organites de la crypte. En outre, nous introduisons une nouvelle méthode pour utiliser des cultures organoïdes crypte pour les essais métaboliques.

Protocol

Cette étude a été réalisée en conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité d'éthique de l'expérimentation animale de l'Albert Einstein College of Medicine.

1. Crypte Isolement et culture

1. Isolation des cryptes de l'intestin grêle:
   1. Isoler cryptes intestinales de tout modèle de souris d'intérêt. Euthanasier les souris avec du CO ₂ suivie d'une dislocation cervicale.
   2. Ouvrez l'abdomen longitudinalement et remplir l'intestin grêle (SI) avec une solution saline tamponnée froid glace phosphate, PBS (-Ca ^2+; -Mg ²⁺⁾ avec 2x antibiotique antifongique (anti-anti). Rapidement isoler l'intestin grêle.
   3. Bien disséquer sans graisse mésentérique aide d'un scalpel. Veillez à ne pas perforer le tissu - en tout temps garder le tissu humide avec PBS glacé. Ouvrez inteStine longitudinalement et laver soigneusement avec du PBS glacé.
   4. Couper l'intestin grêle en deux sections et aplatir à l'aide d'un coton-tige humide, doucement gratter les villosités en utilisant une lame de pré-refroidissement. Laver vigoureusement dans PBS glacé plusieurs fois.
   5. Incuber 3 min dans 20 ml de PBS 1X par 3 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) /0.5 mM de dithiothréitol (DTT) pour la dissociation non enzymatique du tissu.
   6. Couper le tissu en petits morceaux (2-4 mm) en utilisant une lame de rasoir sur une lame de pré-refroidi. Transférer les morceaux dans un tube de 50 ml contenant 20 ml de PBS refroidi à la glace.
   7. Pipette et doucement 10x en utilisant une pipette de 10 ml stérile à usage unique. Laissez fragments de tissus sédimentent par gravité. Retirer le surnageant avec une pipette. Répétez trois fois de plus; assurez-vous surnageant est clair.
   8. Ajouter 20 ml de PBS par 2 mM EDTA. Swirl et incuber à 4 ° C pendant 30 min sous agitation légère.
   9. Laissez sédiments de tissus et éliminer le surnageant. Ajouter 15 ml PBS glacé et pipettede haut en bas 5x avec une pipette de 10 ml. Soit les fragments de tissus et des sédiments recueillir le surnageant comme une fraction (F1). Répéter collecte F2-F5, chaque fraction maintenu séparément.
   10. Ajouter 15 ml PBS glacé et cette fois agiter vigoureusement à la main pendant 15 secondes. Recueillir F6 et F7 pour répéter, F8. Si des morceaux de tissus commencent à flotter, appuyez sur pour les aider à régler.
   11. Inspecter une partie aliquote de chaque fraction sous le microscope. Mettent en commun les fractions contenant cryptes.
   12. Faire passer les fractions combinées à travers un tamis cellulaire en nylon de 70 pm, la collecte des cryptes dans un tube de 50 ml.
   13. Centrifugeuse à 100 g pendant 5 min à 4 ° C, éliminer le surnageant et remettre le culot dans 10 ml PBS glacé avec cryptes anti-anti-transfert et 2x à un tube de 15 ml. Répétez le lavage une fois de plus.
   14. Laver les cryptes une fois avec 10 ml glacée ADF, avancée DMEM / F-12 (Dulbecco "s Modified Eagle Medium / Ham" s F-12) - 2x anti-anti.
   15. Laver les cryptes une fois avec 10 ml de ADF - 1x anti-anti.
   16. Comptez le nombre de cryptes en utilisant un hématimètre. Ajuster le volume de la solution de crypte et transférer dans un tube de 1,5 ml de sorte que la concentration finale de la crypte sera remis en suspension lors de 100-500 cryptes par 50 pi de mélange de protéines gélatineux (Matrigel). Centrifuger à 100 g pendant 5 min à 4 ° C et remettre les cryptes dans le mélange de protéine gélatineux.
   17. Plaque 50 pi de crypte - gélatineux suspension de mélange de protéines par puits dans une plaque de 24 puits (zone de croissance: 2 cm ^2), plaçant soigneusement la chute de suspension au centre de chaque puits. Maintenir la plaque dans un CO _2, à 37 ° C pendant ~ 30 incubateur min jusqu'à ce que la suspension se solidifie.
   18. Ajouter 500 ul médias glacée de culture complet (Advanced DMEM / F12 avec 1x contre - contre 10 mM 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27, supplément de 1x N2, 1 mM N-acétyl-L-cystéine (NAC), 50 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF), 100 ng / mlCaboche, 500 ng / ml R-Spondin).
       1. Reconstituer les facteurs de croissance à 0,1% de sérum-albumine bovine (BSA) dans du PBS.
2. Crypte Organoid Culture et Passage:
   1. Passage organites de la crypte 14-21 jours après l'ensemencement (ou au besoin) comme suit:
      1. Changer médias chaque vendredi et lundi. Le mercredi, remplacer la moitié des médias avec les médias fraîche.
   2. Retirer le milieu de culture. Laver l'échantillon deux fois avec 500 ul de PBS à 5 min d'intervalle.
   3. Retirer du PBS et casser doucement le mélange de protéines gélatineux en utilisant une pointe de micro pipette P1000 stérile.
   4. Ajouter milieux de culture 1 ml complet à un seul puits et remettre en suspension les organites dans 1 ml médias.
   5. Perturber légèrement les organites aide d'un P1000 par aspiration et refoulement 20-30x (vérifier au microscope pour la dissociation organoïde bon avec un bon rendement de la crypte jusqu'à une technique cohérente est développé).
   6. Transférer les cryptes à un tube de 1,5 ml;centrifuger à 100 xg à 4 ° C, 5 min.
   7. Laver le culot deux fois avec 1 ml de milieu de culture complet.
   8. Split à un rapport de 1: 3 ou 1: 6 en tant que besoin, des cryptes remise en suspension dans 50 ul de Matrigel par puits. Procédez comme décrit ci-dessus (section 1.1.16-18).
3. Crypte de congélation Organoid:
   1. Retirer le milieu de culture. Laver l'échantillon avec 500 ul de PBS.
   2. Disperser le mélange de protéines gélatineux en utilisant une pointe de pipette P1000.
   3. Ajouter 1 ml de milieu à un seul puits et remettre en suspension les organites dans 1 ml médias.
   4. Casser délicatement les organites aide d'un P1000 par aspiration et refoulement 20-30x.
   5. Transférer les organites à un tube de 1,5 ml. Centrifugeuse à 100 g à 4 ° C, 5 min.
   6. Laver le culot deux fois avec 1 ml de milieu de culture complet.
   7. cryptes de remettre en suspension dans 500 ul de gel médias.
   8. cryptes de transfert à un cryotube, placer le tube dans un récipient de congélation et de stocker dans un congélateur à -80 ° C overniGHT.
   9. Transfert des cryptes de l'azote liquide ₂ réservoir.
      1. Récupérer organites de la crypte gelés par la fonte rapidement dans un bain d'eau à 37 C °. Laver avec 500 ul de milieu de culture complet une fois, centrifuger à 100 x g, 5 min et remettre en suspension dans le mélange de protéine gélatineuse, et la culture comme décrit ci-dessus. Pour une meilleure récupération, ajouter un inhibiteur de ROCK (Y-27632) au milieu de congélation.

2. Crypte Organoid métabolisme Assay

1. Plaque de 24 puits Préparation:
   1. Isoler et compter cryptes selon le protocole (voir la section 1.1 pour l'isolement de la crypte et la section 1.2 pour le passage de la crypte).
   2. cryptes de remettre en suspension dans le mélange de protéines gélatineux (100-200 cryptes par 20 pi).
   3. Plate crypte gélatineuse mélange de protéines en suspension dans une plaque de 24 puits essai (assurez-vous qu'il ya au moins trois exemplaires pour chaque échantillon) et permet la suspension se solidifier à 37 ° C en CO ₂incubateur; puis ajouter 500 ul de milieu de culture complet.
   4. cryptes de culture (comme décrit dans la section 1.1) et d'observer au microscope jusqu'à cryptes deviennent des organites pleinement développés.
2. Extracellulaire Flux test:
   1. Hydrate cartouche pendant une nuit dans un non-CO ₂ (0% de CO _2), 37 ° C incubateur.
   2. Retirez le milieu de culture et laver deux fois avec 500 organoïdes DMEM ul (sans: glucose, L-glutamine, du pyruvate de sodium et de bicarbonate de sodium et avec: rouge phénol). Attendez 5 min.
   3. Ajouter 675 ul par puits milieu analytique (DMEM avec 2 mM de L-glutamine et 5 mM de D-glucose) dans chaque puits.
   4. Vérifier morphologie microscopique de crypte de sorte que organites et le mélange de protéines gélatineux sont intactes après les lavages. Incuber 1 heure à une non-CO _2, 37 ° C incubateur.
   5. Préparation des composés 10 uM injectables (oligomycine, le carbonyl cyanide p-trifluoro-méthoxy-phényl-hydrazone (FCCP), rotenone) en milieu de dosage.
   6. Mise en place de la cartouche en chargeant 75 pi de 10 um composés injectables dans les ports de la cartouche de façon séquentielle: Port A - oligomycine; Port B - FCCP; Port et C - roténone (Les concentrations finales au cours de l'essai sera de 1 M).
   7. Incuber cartouche 30 min - 1 heure à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ non.
   8. En même temps, activez l'Analyzer XF et créer le modèle de protocole d'essai.
   9. Insérer la cartouche et la plaque d'utilité dans Analyzer XF et exécuter "calibrer" cartouche.
   10. Vérifiez organites de la crypte au microscope afin de s'assurer qu'ils sont attachés au mélange de protéines gélatineux.
   11. cellule de charge plaque de culture dans le protocole d'essai de l'appareil et l'exécution.

Representative Results

Organites crypte ont été établies à partir de 8 mois C57BL / 6 Fed purifié alimentation des rongeurs American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Organites des cryptes intestinales peuvent être mises en culture pendant des périodes prolongées d'un seul crypte (figure 1A, seule flèche rouge). Organites poussent hors des structures de la crypte comme dans 18-20 jours de culture (figure 1B, flèches rouges). Cryptes ont été passées toutes les 3 semaines et organites efficacement récupérés après chaque passage.

Seahorse bioénergétique instrumentation peut évaluer les taux de la respiration mitochondriale et la glycolyse simultanément dans la croissance des cellules en culture en temps réel. Nous avons adapté cette technologie pour doser le métabolisme organoïde crypte. Avec organites dérivés de souris nourries AIN76A régime purifié pendant 8 mois, nous avons mesuré:. 1 taux de consommation d'oxygène, OCR illustré à la figure 2A - ligne rouge représentant le taux de consommation d'oxygène (pmol / min) en organites de la crypte, le bleu est eles puits témoins e uniquement avec du Matrigel (le mélange de protéines gélatineux); 2. taux extracellulaire de l'acidification (ECAR) montre la figure 2B - ligne rouge représente la vitesse d'acidification extracellulaire (mph / min) en organites de la crypte, le bleu est les puits de contrôle seulement avec le mélange de protéines gélatineux.

Figure 1:. Organites Crypt issus de 8 mois vieilles souris C57BL / 6 cryptes sont (a) de 2 jours ou (B) de 18 jours de culture. Echelle: 100 um.

Figure 2: Analyse bioénergétique dosage utilisant organites dérivés de 8 mois vieilles souris C57BL / 6. (A) le taux de consommation d'oxygène (OCR) est montré;

Discussion

Nous avons testé le taux de consommation d'oxygène (OCR) et le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) de cryptes isolées à partir de souris âgées de 8 mois et cultivées en organites ex vivo. Après la mesure du taux de base, le métabolisme crypte a été évaluée en ajoutant oligomycine, cyanure de carbonyle -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) et la roténone, séquentiellement.

Basal OCR et ECAR base ont été enregistrées 0-29 min (figure 2A et 2B). A la ^29ème minute, oligomycine (à partir de l'orifice A) a été injecté dans chaque puits (n = 3, pour les deux cryptes et les puits témoins). Oligomycine est un inhibiteur de la synthèse d'ATP. Il est utilisé pour prévenir l'état 3 (phosphorylation) respiration. Ainsi, oligomycine injection a entraîné une légère réduction de l'OCR, en raison de blocus de la synthèse d'ATP dans les mitochondries, et les cryptes mis à la glycolyse pour répondre à leurs besoins en ATP résultant en une augmentation de l'ECAR. A la 64 ^e min, FCCP (BOFm Port B) a été injecté dans chaque puits. FCCP est un porteur d'ions mobiles, le transport des ions hydrogène à travers la membrane mitochondriale, ce qui conduit à la consommation d'énergie rapide sans avoir recours à la génération d'ATP. OCR augmenté en raison de découplage et ECAR augmenté depuis les cryptes ont maintenu leur bilan énergétique en utilisant la glycolyse pour générer l'ATP, ainsi synthétiser et sécréter de l'acide lactique. A la 99 ^ème minute, la roténone (à partir de l'orifice C) a été injecté dans chaque puits. La roténone est un inhibiteur mitochondrial. Ainsi, la troisième injection a conduit à une diminution de l'OCR en raison de troubles de la fonction mitochondriale et déplacé les cryptes à un état plus glycolytique en gardant les valeurs ECAR élevées.

Il ya deux conclusions principales: 1) organites de la crypte de huit mois vieilles souris ont été cultivées avec succès par plusieurs passages; 2) organites qui avaient été exposées à la culture pendant 2 mois après dérivation a présenté une réponse métabolique à oligomycine, cyanure de carbonyle-p-trifluoromethoxyphen ylhydrazone et la roténone. Ainsi, la capacité de la glycolyse des organites était stable après 2 mois de culture, en conformité avec le rapport que organites de souris soumis à restriction calorique sont relativement adaptés en permanence à la croissance différente et phénotypes métaboliques dans la culture ^12.

Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole sera d'une grande importance dans les études métaboliques des cryptes intestinales. Le protocole de l'isolement de la crypte est adapté de Sato et al. ¹⁰ Le protocole pour étudier le métabolisme de crypte dans les petites cultures organoïdes cryptes intestinales en utilisant la technologie d'analyse bioénergétique n'a pas été signalée. Les études sur le métabolisme organoïdes cryptes peuvent être étendus en outre l'introduction de diverses variables à des milieux de culture et des conditions de dosage, telles que des sources d'énergie différentes, des inhibiteurs et activateurs de la signalisation spécifique et voies métaboliques, et des conditions hypoxiques qui peuvent moduler des voies métaboliques.

ontenu "> Il ya des problèmes techniques qui nécessitent une attention particulière lors de l'application de ces protocoles. nombre crypte et l'efficacité des cultures organoïdes crypte de croissance peuvent varier en fonction de la source de la crypte, par exemple cryptes de génétiquement modifié par rapport à des souris de type sauvage Ainsi, la densité. de semis crypte peut être ajusté pour des expériences en exécutant un essai. En outre, cryptes et organids ont une forte tendance à coller aux surfaces. Pour de meilleurs rendements, tous les tubes (1,5 ml, 15 ml et 50 ml tubes), pipettes et embouts de pipette peuvent être enrobés avec 1% de sérum fœtal bovin dans du tampon phosphate salin à 4 ° C pendant une nuit. Les résultats peuvent être normalisés par rapport à la concentration totale en protéines en utilisant l'acide bicinchoninique (BCA) essai. Après le test métabolique, la plaque à 24 puits est maintenue sur de la glace jusqu'à ce que le BCA essai. Pour le dosage BCA, cryptes sont lavées doucement dans 500 ul de PBS froid et lysées trois fois dans 75 ul de NaOH 0,1 N dans du PBS puis on a agité pendant 1 h à température ambiante vigoureuse. Une pipette P1000 peuventêtre utilisé pour briser le mélange de protéines et gélatineux pipetage de haut en bas favorise la lyse. Après la lyse crypte, le protocole standard de dosage BCA pour les cellules peut être suivie. Il est important d'avoir "seulement" Matrigel puits de contrôle à travers l'analyse bioénergétique pour mesurer la concentration de la protéine de fond dans ces puits, et ainsi d'évaluer la concentration de la protéine de crypte avec précision par le test de BCA.

Études de métabolisme organoïde Crypt présentée peut être appliquée à des mini-tripes épithéliales normales et dérivées patient à explorer l'utilité pour l'évaluation précoce du risque et approches qui peuvent moduler le phénotype métabolique et ainsi diminuer le risque maladie relative. Les tests métaboliques décrites ici introduisent de nouvelles stratégies pour permettre l'évaluation du risque relatif de développement de la maladie et pour la détection précoce de l'état de la maladie, sa dissection biochimique et moléculaire et modulation du potentiel. En résumé, nous décrivons un protocole détaillé pour isoler petit intestinal cryptes et organites culture de la crypte. En outre, nous introduisons une nouvelle méthode à utiliser crypte organoïde culture pour déterminer l'acidification et la consommation d'oxygène des taux extracellulaires d'étudier le métabolisme énergétique de la crypte. Ex vivo crypte organoïde culture métabolique études de profilage va définir de nouvelles stratégies pour la compréhension de la biologie intestinal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free	BD Biosciences	356231
PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D5030
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	P4758	Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml	Life Technologies	15240-062	Final concentration 1x or 2x
Penicilin-Streptomycin, liquid	Life Technologies	15140-122	Final concentration 1x
Gibco® GlutaMAX™ supplement	Life Technologies	35050061	Final concentration 1x
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M	Life Technologies	15630-080	Final concentration 10 mM
N-acetyl-L-cysteine, 25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Final concentration 1 mM
100x N-2 supplement, liquid	Invitrogen	17502-048	Final concentration 1x
50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid	Invitrogen	12587-010	Final concentration 1x
Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg	R&D Systems	3474-RS-050	Final concentration 500 ng/ml
Recombinant Murine EGF, 100 μg	Peprotech	315-09	Final concentration 50 ng/ml
Recombinant Murine Noggin, 20 μg	Peprotech	250-38	Final concentration 100 ng/ml
Gibco® L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Final concentration 2 mM
Gibco® glucose powder	Life Technologies	15023-021	Final concentration 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8

Name	Company	Catalog Number	Comments
DTT (dithiothreitol), 1M	Life Technologies	P2325	Final concentration 3 mM
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	0.1% in PBS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044	1% in PBS
Recovery™ Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies	12648-010
ROCK inhibitor (Y-27632)	Sigma-Aldrich	Y0503	Final concentration 10 μM
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	Final concentration 1 μM
Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	Final concentration 1 μM
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Final concentration 1 μM
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	Final concentration 0.1 N in PBS
XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)	Seahorse Bioscience