여기에서는 단백질의 형광 강도를 적절한 내부 표준물질의 농도로 정규화하여 중심체에서 단백질의 수준 변화를 측정하기 위해 새로운 정량적 형광 분석법이 개발되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
중심체는 게놈 무결성을 유지 또는 세포에서 감각 기능을 용이하게하기 위해 차 섬모를 조립하는 유사 분열 스핀들의 기둥 역할을 작지만 중요한 소기관이다. 단백질의 수준은 다른 위치들에서보다 .cellular 중심체에서 다르게 조절 될 수 있고, 세포주기의 여러 다른 지점에서의 centrosomal 단백질 레벨의 변화는 중심 소체 조립체의 적절한 조절에 중요한 것으로 보인다. 우리는 세포주기의 다른 단계에서와 같은 각종 시약으로 처리 한 후 다른 샘플들로부터 고정 된 세포 중심체에서 단백질의 상대 수준의 변화를 측정하는 정량적 형광 현미경 분석법을 개발 하였다. 이 분석의 원리는 소 영역에서의 단백질에 대응하는 배경 보정 된 형광 강도를 측정에 놓여, 및 선택된 실험 C 하에서 변하지 않는 또 다른 단백질에 대해 동일한 측정을 정상화 그ondition. BrdU의 펄스와 교란 세포주기를 연구 추격 전략과 함께이 분석을 활용하여, 우리는 정량적으로 특별히 중심체에서 프로 테아 좀 중재 저하에 의해 가능성이 VDAC3의 centrosomal 풀 세포주기 동안 중심체에서 규제되고 우리의 최근의 관찰을 검증했다.
서론
중심체는 pericentriolar 물질 (PCM)으로 둘러싸인 중심 소체의 쌍으로 구성되어 있습니다. 포유 동물 세포의 주요 미세 소관 조직 센터 (MTOCs)이기 때문에, 중심체는 분할 세포에서 유사 분열 스핀들의 두 기둥 역할을하고, 따라서 게놈 무결성 1을 유지하는 데 도움이. (G0 단계에서 예) 대기 세포에서, 중심체, 즉 머더 중심 소체의 두 중심 소체 중 하나는 일차 섬모, 세포 표면 (2)로부터 돌출 감각 소기관 조립 기부 본체로 변형된다. 일단 세포가 세포주기를 다시 입력 일차 섬모 분해하여 각 중심 소체 서서히 성숙한 중심 소체 (3)을 형성하는 그것의 신장 기단부 procentriole의 조립을 지시한다. S 단계의 개시시에 중심 소체 9 대칭성을 제공 수레 바퀴 형 구조는 기존의 각 중심 소체의 표면에 형성되고, 각각의베이스 procentriole해질 것이다. Sas6의 t중심 소체 조립체 4-6 수레 바퀴의 중심을 형성하기 위해 채용되는 모자 불가결하다. 다른 centriolar 단백질은 말초 방식으로 7 엄격한 규제, 근위부의 수레 바퀴에 조립된다. 정확하게 중심 소체 중복을 완료 한 후, 세포를 G2 단계 (8)의 단부가 두 기능....
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프로토콜
1. 세포 배양
- 역전사 효소 (는 hTERT) 불후의 망막 색소 상피 세포 인간 텔로 머라 아제를 사용 (의 hTERT-RPE1하면, RPE1 여기 함).
주 : RPE1 세포 일반적 중심 소체 조립체와 ciliogenesis을 연구하는 데 사용되는 근거리 이배체 인간 형질 전환되지 않은 세포이다. 이 세포들은 규제 세포주기와 조정 정상적인 중심 소체 중복주기를 따르십시오. - 통로 1에서 RPE1 세포의 거의 합류 100mm 세포 배양 접시 : 10 ㎖를 함유하는 신선한 100mm 접시에 원래 배양 5 희석 DME / F-12 (1 : 1) 중 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ml의 페니실린 G 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 (전체 매체가 DME / F-12 매체로 함). 5 % CO 2 존재하에 37 ℃에서 세포를 성장한다.
- 물 목욕이나 인큐베이터에서 60 ° C에서 흔들림없이 덮여 유리 비커, O / N에서 1 N 염산 50ml에 12mm 라운드 커버 글라스를 품어.
- AF산 용액을 폐기 터가 가끔 흔들어 15 분간 배양하여 커버 슬립을 증류수 100㎖를 세 번 씻는다. 70 % 에탄올 및 95 % 에탄올 중의 마찬가지로 세탁을 반복.
- 개별적으로....
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결과
우리의 최근의 연구 VDAC3, 미토콘드리아 porins 16, 28 중 하나의 새로운 centrosomal 현지화 및 기능을 확인했다. VDAC3 특이 항체를 이용한 RPE1 세포를 포함한 여러 포유 동물 세포의 면역 염색 띄는 centrosomal 염색 비교적 약한 미토콘드리아 염색을 보여 주었다. 우리는 또한 centrosomal VDAC3이 우선적으로 어머니 중심 소체 및 내인성 모두의 centrosomal 풀과 연관된 및 ectopically VDAC3이 저하 (16)에 의해 규제되는 표현되는 것을 보여 주었다. 양적 IIF 분석을 검증하기 위해 우리는 S 상에있는 세포의 중심체 관련 VDAC3 풀의 변화를 조사했다.
여기서, 비동기식 성장 RPE1 세포는 프로 테아 좀 억제제 MG115 또는 4 시간 동안 제어 중 DMSO 용매로 처리 하였다. S 상과 중심체 어셈블리를 겪고에있는 세포에 대한 우리의 분석을 제한하려면, 우리는.......
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토론
세포 생물학의 양적 현미경은 일반적으로 고정 된 다른 양적 현미경 분석을 개발하고 세포 생물학의 성장 사례가있다, 그러나 등 (FRAP) 광표백 후 같은 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 형광 복구와 같은 라이브 세포 이미징 분석과 연관된 최근 몇 년 동안 27,34-36 세포. 중요한 것은, 중심체 생물학을 이해 진행은 종종 centrosomal 풀을 다른 풀과 다르게 조절 될 수있다 단백질의 중심체 특정 기능에 대한 이해가 필요합니다. 따라서, 우리는 특별히 다르게 취급 두 시료에서 단백질의 상대적인 수준을 centrosomal 분석 IIF 정량 분석법을 개발 하였다. 이 세포가 분리 된 고정 된 커버에 처리되는 것을 요구하기 때문에, 우리는 따라서 두 experime 인해 취급 필요성 가능한 아티팩트에 더 정규화 제어의 목적으로 내부 표준 도입ntal 세포 집단은 별도로하고, 분석의 정확성을 증가시킨다. 시험 단백질의 상대적 형광 강도를 측정하는 등의 내부 표준을 사용한 이전 연.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, GM77311)과 오하이오 암 연구소(Ohio Cancer Research Associates)의 종자 보조금(H.A.F.)의 지원을 받았습니다. SM은 오하이오 주립 대학 종합 암 센터의 인간 암 유전학 프로그램의 Up on the Roof 펠로우십의 일부 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Fibronectin | Sigma | F8141 | 물 속에 1 mg/ml 재고 |
| DMSO | Sigma D2650 | ||
| MG115 | Sigma | SCP0005 | DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | 10 mM 재고 |
| ;-tubulin (마우스 단클론, 클론 GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 IIF 차단 버퍼 |
| Anti-VDAC3 (토끼 다클론성) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | IIF 차단 버퍼에서 1:50, WB 차단 버퍼에서 1:1,000 |
| Anti-Sas6 (마우스 단클론) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF 차단 버퍼 |
| Anti-Cep135 (토끼 다클론) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF 차단 버퍼 |
| Anti-BrdU (랫 단클론) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF 차단 버퍼 |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF 차단 버퍼 |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) 항체 | Life technologies | A21202 | 1:1,000 in IIF 차단 버퍼 |
| Alexa Fluor 594 당나귀 Anti-Mouse IgG (H+L) 항체 | Life technologies | A21203 | 1:1,000 in IIF 차단 버퍼 |
| Alexa Fluor 488 당나귀 Anti-Rabbit IgG (H+L) 항체 | Life technologies | A21206 | 1:1,000 in IIF 차단 버퍼 |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1,000 in IIF blocking buffer |
| Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1,000 in WB blocking buffer |
| Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20,000 in WB 블로킹 버퍼 |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10,000 in WB 블로킹 버퍼 |
| Mouse IgG (H& L) 항체 IRDye800CW Conjugated | Rockland 항체 | 610-731-002 | 1:10,000 in WB 차단 버퍼 |
| SlowFade Gold Antifade 시약 | Life technologies | S36936 | 마운팅 미디어 |
| 라운드 커버슬립 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 현미경 | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR 카메라 | QImaging | 32-0082B-238 | |
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| U-MNU2 내로우 그린 큐브 | 올림푸스 | U-M663 | 필터 |
참고문헌
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
- Azimzad....
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